茯苓菌絲常規培養和復壯培養的條件優化*

向 蒙，熊詩俊，彭逸斯，黃莉萍，何 鮮，張瑤婷，彭國平**

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128； 2.道地藥用植物規范化栽培綜合利用湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410128；3.靖州康源苓業科技股份有限公司，湖南 懷化 418400；4.懷化市中藥材規范化栽培與產地無硫干燥工程技術研究中心，湖南 懷化 418400）

茯苓[Wolfiporia cocos（shw.）Rvy.&Gilbn]為擔子菌門（Basidiomycota）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）茯苓屬（WolfiporiaRvy.&Gilbn）腐生菌，多寄生于馬尾松（Pinus massonianaLamb）和赤松（Pinus densifloraSiebold &Zucc）的根部，是我國重要的“藥食同源”中藥材之一[1]。茯苓菌絲扭結在一起硬化后形成菌核，即為茯苓藥材加工的原料[2]。人工栽培需要先收集野生茯苓菌種，再通過良種篩選和繁育獲得優良栽培品種，難度大、周期長、費用高。而菌種經多代無性繁殖會導致退化，加上雜菌污染會使菌種更加不純，在生產上常出現低產、空窖、爛窖的現象，嚴重降低了茯苓的生產效率。優良菌種培養和退化菌種復壯是使茯苓增產、增效最有效的措施之一。

通過對茯苓菌絲常規培養基和復壯培養基中的碳源、氮源、初始pH 以及培養溫度進行優化，篩選出茯苓菌絲常規培養與復壯培養的最適培養基與培養條件，以期為茯苓的人工栽培提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

供試茯苓菌核由靖州康源苓業科技股份有限公司于2021年3月提供。

1.1.2 主要試劑

酵母膏、蛋白胨、玉米蛋白粉、瓊脂粉均為生化試劑，上海盛思生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、（NH4）2SO4、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；HCl、NaOH 均為分析純，株洲市星空化玻有限責任公司。

1.1.3 主要儀器

FA-2014N 型電子天平，上海菁海儀器有限公司；SW-CJ-1F 型超凈工作臺，蘇州設備凈化有限公司；LBI-250 型恒溫培養箱，上海龍躍儀器設備有限公司；DHG-9140A 型電熱鼓風干燥箱，中儀國科科技有限公司；GI54DWS 型高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茯苓菌絲分離純化

將供試茯苓菌核從中間部位切開，在切面中心部位切取數塊大小基本一致的菌塊，將菌塊接種到固體培養基中央，在25 ℃條件下恒溫培養。將純化后的菌絲進行常規培養。

1.2.2 茯苓待復壯菌絲準備

將連續培養20 代以上，已出現退化現象的茯苓菌絲活化培養96 h 后，采用尖端菌絲分離法[3]，用牛津杯打孔取長勢好的尖端外緣3 mm 處的菌絲，將其轉接到培養基中，25 ℃恒溫培養96 h，重復操作2 次。

1.2.3 菌絲生長速度測定

試驗均在直徑為9 cm 的培養皿中進行，待菌種培養至48 h 時在菌落外緣處畫初始線，培養至96 h時在菌落外緣處畫終止線。測量初始線和終止線間的距離，生長速度（C，cm·d-1）的計算公式為：

C=D/2

式中：D為初始線與終止線間的距離（cm）。

1.2.4 培養條件篩選單因素試驗

基礎培養基（G）的配方為：酵母膏0.5 g、MgSO4·7H2O 0.125 g、KH2PO40.25 g、K2HPO40.115 g、瓊脂5 g，加水250 mL[4]。

1）碳源篩選試驗：在G 中加入（NH4）2SO40.5 g為氮源，再分別加入5 g 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉，得到配方C1、C2、C3、C4，將pH 調至6.0。接種后將培養皿置于25 ℃條件下培養。

2）氮源篩選試驗：在G 中加入葡萄糖5 g 為碳源，再分別加入0.5 g 蛋白胨、玉米蛋白粉、（NH4）2SO4和NH4NO3，得到配方N1、N2、N3、N4，將pH 調至6.0。接種后將培養皿置于25 ℃條件下培養。

3）培養溫度篩選試驗：在G 中加入葡萄糖5 g、（NH4）2SO40.5 g，將pH 調至6.0。接種后分別將培養皿置于22、25、28、31、34 ℃條件下培養，編號分別為T1、T2、T3、T4、T5。

4）初始pH 篩選試驗：在G 中加入葡萄糖5 g、（NH4）2SO40.5 g 后，將pH 分別調至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，得到配方P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11。接種后將培養皿置于25 ℃條件下培養。

1.2.5 正交試驗

依據單因素試驗結果，以培養基中的碳源、氮源、初始pH、培養溫度為變量因素（各設3 個水平），以生長速度及菌落形態特征為評價指標，進行L9（34）正交試驗，優化茯苓菌絲常規培養和復壯培養條件。菌絲常規培養及菌絲復壯培養正交試驗因素水平見表1 和表2。

表1 菌絲常規培養正交試驗因素水平Tab.1 Levels and factors of orthogonal design for mycelial routine culture

表2 菌絲復壯培養正交設計因素水平Tab.2 Levels and factors of orthogonal design for mycelial rejuvenation culture

1.2.6 茯苓菌絲復壯前后對比試驗

分別將完成復壯培養的菌絲和退化菌絲接種于固體培養基中央，于25 ℃條件下培養96 h 后，觀察菌落形態、菌絲的顯微特征，并測定菌絲生長速度。

1.3 數據分析

采用Excel 2020 進行數據統計分析，SPSS 26.0進行顯著性分析、聚類分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 茯苓菌絲常規培養及復壯培養的單因素試驗結果

2.1.1 碳源篩選試驗結果

碳源對茯苓菌絲長勢、生長速度及菌落形態的影響情況見表3、圖1 和圖2。

圖1 碳源對茯苓菌絲生長速度的影響Fig.1 Effect of carbon source on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖2 碳源對茯苓菌落形態的影響Fig.2 Effect of carbon source on colony morphological of Wolfiporia cocos

表3 碳源對茯苓菌絲長勢的影響Tab.3 Effect of carbon sources on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表3、圖1 和圖2世紀，以葡萄糖（C1）作為碳源時，菌絲常規培養和復壯培養中的茯苓菌絲生長速度均最快，菌絲潔白、綿密，菌苔較厚，復壯效果最好。

2.1.2 氮源篩選試驗結果

氮源對茯苓菌絲長勢、生長速度及菌落形態的影響情況見表4、圖3 和圖4。

圖3 氮源對茯苓菌絲生長速度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖4 氮源對茯苓菌落形態的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on colony morphological of Wolfiporia cocos

表4 氮源對茯苓菌絲長勢的影響Tab.4 Effects of nitrogen sources on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表4、圖3 和圖4世紀，（NH4）2SO4（N3）與酵母膏聯合作為氮源時，菌絲常規培養和復壯培養中的茯苓菌絲生長速度均最快，菌絲潔白、綿密，菌苔較厚，復壯效果最好。

2.1.3 培養溫度篩選試驗結果

溫度對茯苓菌絲長勢、生長速度及菌落形態的影響情況見表5、圖5 和圖6。

圖5 溫度對茯苓菌絲生長速度的影響Fig.5 Effect of temperature on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖6 溫度對茯苓菌落形態的影響Fig.6 Effect of temperature on colony morphological of Wolfiporia cocos

表5 溫度對茯苓菌絲長勢的影響Tab.5 Effect of temperature on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表5、圖5 和圖6世紀，從22～34 ℃溫度越高菌絲生長速度越快，28～34℃下菌苔較厚。茯苓菌絲復壯培養中25 ℃條件下菌絲生長速度最快，但菌苔稀薄；28～34 ℃下茯苓菌絲生長速度較快，菌絲綿密、色白，菌苔厚，生長旺盛。因此，28～34 ℃適宜進行茯苓菌絲常規培養和復壯培養。

2.1.4 pH 篩選試驗結果

pH 對茯苓菌絲長勢、生長速度及菌落形態的影響情況見表6、圖7 和圖8。

圖7 pH 對茯苓菌絲生長速度的影響Fig.7 Effect of pH on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖8 pH 對茯苓菌落形態的影響Fig.8 Effect of pH on colony morphological of Wolfiporia cocos

表6 pH 對茯苓菌絲長勢的影響Tab.6 Effects of pH on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表6、圖7 和圖8世紀，茯苓常規培養中，初始pH 在5.0～7.0 時茯苓菌絲生長速度較快，菌絲綿密、色白，生長旺盛；pH<5.0 時茯苓菌絲生長速度較慢，pH>7.0 時生長速度快速下滑。在復壯培養中，初始pH 為4.0 和pH 為5.5～7.0 時菌絲長勢和品質較好，且初始pH 為4.0 時更有利于茯苓菌絲的復壯；相比之下pH 為7.5～9.0 時菌絲生長速度較慢。說明堿性環境不利于菌絲生長。

根據菌絲生長速度，采用IBM SPSS Statistics 26進行聚類分析。常規培養的聚類分析結果見圖9。

圖9 菌絲常規培養中不同pH 茯苓菌絲生長狀況聚類圖Fig.9 The cluster diagram of mycelial growth of Wolfiporia cocos with different pH in mycelial routine culture

如圖9世紀，在菌絲常規培養中，11 個不同pH處理組聚為4 類，第1 類為P2、P3、P4、P5、 P6、P7，菌絲生長速度為0.81～0.91 cm·d-1；第2 類為P1、P8、P9，菌絲生長速度為0.72～0.77 cm·d-1；第3 類為P10，菌絲生長速度為0.6 cm·d-1；第4 類為P11，菌絲生長速度為0.46 cm·d-1，生長較慢。方差分析結果顯示，4 類之間存在顯著性差異（P<0.05）。

復壯培養試驗中的聚類分析結果見圖10。

圖10 菌絲復壯培養中不同pH 茯苓菌絲生長狀況聚類圖Fig.10 The cluster diagram of mycelial growth of Wolfiporia cocos with different pH in mycelial rejuvenation culture

如圖10世紀，菌絲復壯培養中，11 個不同pH處理組聚為4 類，第1 類為P1、P4、P5、P6、P7，菌絲的生長速度為0.92～0.99 cm·d-1，生長最快；第2類為P3，菌絲的生長速度為0.83 cm·d-1，生長較快；第3 類為P10、P11，菌絲的生長速度為0.39～0.48 cm·d-1，生長最慢；第4 類為P2、P8、P9，菌絲的生長速度為0.63～0.73 cm·d-1，生長速度較慢。方差分析結果顯示，4 類之間差異顯著（P<0.05）。綜上，茯苓適合在弱酸性的環境下進行常規培養和復壯培養。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 茯苓菌絲常規培養正交試驗結果

茯苓菌絲常規培養條件正交試驗結果詳見表7，菌落生長情況詳見圖11。

圖11 正交試驗中茯苓菌絲常規培養菌落形態Fig.11 Colony morphological of routine culture of Wolfiporia cocos in orthogonal experiment

表7 茯苓菌絲常規培養條件優化正交試驗結果Tab.7 Results of orthogonal experiment on conditions optimal of routine culture of Wolfiporia cocos

如表7 和圖11世紀，各因素對茯苓菌絲生長速度的影響大小依次為Z>Y>W>X，最優組合為Z2Y2W3X1，即碳源為葡萄糖、氮源為玉米蛋白粉、培養基初始pH 6.0、培養溫度31 ℃最適合茯苓菌絲常規培養。除5 號培養皿中菌絲生長緩慢，6 號菌絲稀疏外，其余培養皿中菌絲均潔白、綿密，且菌苔較厚。

菌絲常規培養正交試驗方差分析結果詳見表8。

表8 方差分析Tab.8 Variance analysis

由表8 可知，碳源種類、氮源種類、培養基初始pH、培養溫度極顯著影響菌絲的生長（P<0.01）。

最優條件驗證試驗：以最優組合培養的茯苓菌絲，生長速度平均為1.49 cm·d-1，高于正交試驗中所有組的生長速度；且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。表明葡萄糖做碳源、玉米蛋白粉做氮源、pH 6.0、培養溫度31 ℃是茯苓常規培養的最優條件，且重復性好。

2.2.2 茯苓菌絲復壯培養正交試驗結果

茯苓菌絲復壯培養條件優化正交試驗結果詳見表9，菌落生長情況詳見圖12。

圖12 正交試驗中茯苓菌絲復壯培養菌落形態Fig.12 Colony morphological of rejuvenation culture of Wolfiporia cocos in orthogonal experiment

表9 茯苓菌絲復壯培養條件優化正交試驗結果Tab.9 Results of orthogonal experiment on conditions optimal of rejuvenation culture of Wolfiporia cocos

由表9 和圖12 可知，茯苓菌絲復壯培養中，對菌絲生長速度影響大小依次為Z>W=X>Y，最優組合為Z2W2X2Y1，即碳源為麥芽糖、氮源為蛋白胨、培養基初始pH 為5.5、培養溫度31 ℃。就菌絲生長狀況而言，3 號和6 號培養皿中菌絲雖然生長速度慢，但菌絲最綿密，菌苔較厚；7～9 號培養皿中菌絲生長速度較快，但菌絲稀疏，菌苔較薄。

菌絲復壯培養正交試驗方差分析結果詳見表10。

表10 方差分析Tab.10 Variance analysis

由表10 可知，碳源種類、氮源種類、培養基初始pH、培養溫度極顯著影響菌絲的復壯（P<0.01）。

最優條件驗證試驗：以最優條件培養的茯苓菌絲，生長速度平均為1.45 cm·d-1，高于正交試驗中所有試驗組，且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。表明麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源，pH 為5.5，培養溫度為31 ℃是茯苓菌絲復壯培養最優條件，且重復性好。

退化菌絲復壯前后的生長情況對比結果詳見表11、圖13 和圖14。

圖13 復壯前后茯苓菌落形態特征Fig.13 Colony morphological of Wolfiporia cocos before and after rejuvenation

圖14 復壯前后茯苓菌絲顯微特征Fig.14 Microscopic traits of Wolfiporia cocos mycelium before and after rejuvenation

表11 復壯前后茯苓菌絲的生長情況Tab.11 Mycelial growth of Wolfiporia cocos before and after rejuvenation

由表11、圖13 和圖14 可知，復壯菌絲的生長速度平均為1.45 cm·d-1，相比復壯前提高了178.85%，且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。在400 倍下的顯微觀察結果顯示，退化的茯苓菌絲細長，分叉較少；復壯后的茯苓菌絲粗壯，分叉增多，生長旺盛。

3 結論與討論

在茯苓的實際生產中，菌種常因長時間保藏發生退化，目前還缺乏解決該問題的有效方法，這嚴重影響了茯苓的生產效率和品質。現代育種方法，例如原生質體技術，可在退化菌種復壯的基礎上通過改良性狀，使其重新恢復生活力[5]。李云夢等[6-7]在對平菇菌株的提純與復壯以及金針菇復壯技術的研究中發現，尖端分離法對菌種的復壯有較好的效果。劉小霞等[8]通過改變培養基碳源以復壯草菇退化菌種的試驗，為研究茯苓的復壯提供了思路。

通過比較不同碳源、氮源、初始pH 和培養溫度對茯苓菌絲常規培養和復壯培養的影響，發現麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉三者相比，分別以葡萄糖、麥芽糖作為碳源更有利于茯苓菌絲的常規培養和復壯培養；蛋白胨、玉米蛋白粉和NH4NO3三者相比，分別以玉米蛋白粉、蛋白胨聯合酵母膏作為氮源更有利于茯苓菌絲的常規培養和復壯培養。液體培養研究表明，初始pH 為5.5 時最有利于茯苓菌絲的培養，當初始pH 高于7.0 時，茯苓菌絲的生長受到明顯抑制[9-10]。本試驗結果也表明初始pH 為6.0 有利于茯苓的常規培養，初始pH 為5.5 有利于菌絲復壯培養，當初始pH＞7.0 時，茯苓菌絲生長會受到明顯抑制。有研究表明當初始pH 為4.0 時有利于茯苓菌絲的復壯，可能是由于pH 稍低時更有利于刺激茯苓菌絲生理功能的恢復[6]。但較低的pH 環境會造成培養基不易凝固，因此條件還有待進一步優化。此外試驗結果表明31 ℃有利于茯苓菌絲的常規培養和復壯培養。綜上，茯苓菌絲常規培養的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是玉米蛋白粉；復壯培養的最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是蛋白胨聯合酵母膏；2 個過程均宜在弱酸環境、溫度為31 ℃條件下進行。