灰樹花己糖轉運蛋白的生物信息學分析*

艾 鑫，敬隆鑫，趙文君，律鳳霞，賈健輝

（牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157011）

灰樹花（Grifola frondosa），又名貝葉多孔菌、舞茸等，屬于真菌門（Eumycota）擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）無隔擔子菌亞綱（Polyporales）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科（Polyporaceae）樹花菌屬（Grifola）[1-2]。灰樹花為中溫型、喜光、好氧的木腐菌，子實體由菌柄和菌蓋疊生而成，菌肉白色，菌管延生；孢子卵圓形至橢圓形，無色、光滑；其味如雞絲，脆如玉蘭，享有“食用菌王子”和“華北人參”的稱號，在全球菌類中產量排名較為靠前[3-6]。灰樹花的蛋白質含量高達31.5%，必需氨基酸含量占總氨基酸的45.5%，遠高于香菇（Lentinus edodes）、銀耳（Tremella fuciformis）、黑木耳（Auricularia auricula）等常見食用菌[7-9]。此外還富含糖類、萜類、酸類等物質，因此具有多種生理功能，如所含的多糖具有抑制腫瘤、與其他物質協同誘導腫瘤細胞死亡、降低血糖、促進免疫調節、保護肝臟、抑制艾滋病病毒增殖、減輕艾滋病相應癥狀、抗病毒、抗氧化、抗輻射、調節血脂、降血壓等作用[10-23]。

己糖轉運蛋白（HXT2）屬于易化子超級家族MFS（major facilitator superfamily），是一種膜結合蛋白分子，具有12 個跨膜結構域，氨基端和羧基端各有6 個跨膜區，其具有很高的同源性[24-26]。己糖轉運蛋白還是一種重要的糖載體蛋白，主要功能是己糖的攝取和己糖由胞外向胞內的運輸[27]。作為一種高親和、低承載的己糖轉運體，HXT2 蛋白可影響宿主糖的攝取、代謝和基因表達，主要在葡萄糖、半乳糖、果糖等糖的轉運中起作用[28-30]。

通過以灰樹花轉錄組數據為依據，篩選灰樹花己糖轉運蛋白（GfHXT2）的cDNA 序列，并利用生物信息學方法，對該蛋白的理化性質、親/疏水性、信號肽、結構特征、蛋白修飾位點和蛋白交互網絡等方面進行預測和分析[31]，以期為灰樹花己糖轉運蛋白相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

灰樹花樣品來自牡丹江師范學院生物實驗室。

1.1.2 試驗設備

ST16R 高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；PTC200 熱循環儀，美國MJ 公司；UV-1700紫外分光光度儀，上海奧析科學儀器有限公司；A100 型全觸控屏PCR 儀，杭州朗基科學儀器有限公司；DZKW-4 水浴鍋，北京恒奧德科技有限公司；FA1604 電子分析天平，賽輪儀器；YY-16D 電泳儀，杭州諾丁科學器材有限公司；恒溫培養箱BLC-25-II，北京陸希科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰樹花轉錄組數據獲取

提取灰樹花總RNA，基于SBS（sequencing by synthesis，SBS）技術，以IIIumina Hiseq 高通量平臺對RNA 進行轉錄組測序，對原始數據進行拼接、過濾、重建形成轉錄組Unigenes。

1.2.2 灰樹花己糖轉運蛋白生物信息學分析軟件

用于進行灰樹花己糖轉運蛋白（GfHXT2）生物信息學分析的軟件信息詳見表1。

表1 生物信息學分析工具Tab.1 Bioinformatics analysis tools

利用如表1世紀的軟件，對GfHXT2 蛋白的理化性質、親/疏水性、信號肽、亞細胞定位、跨膜螺旋結構、保守結構域、二級結構、三級結構、蛋白修飾位點和蛋白交互網絡進行預測分析。

2 結果與分析

2.1 理化性質預測結果

用ProtParam 軟件對GfHXT2 對應的基因序列進行分析，結果顯示該基因全長為1 871 bp，編碼區（CDS）為304～1 446 bp，共編碼380 個氨基酸。分子式為C2434H3764N622O670S14，相對分子質量為52 909.27，總原子數為7 504，理論等電點（pI）為6.27，堿性氨基酸總數（Arg+Lys）為36，酸性氨基酸總數（Asp+Glu）為39，親水性平均水平為0.286。不穩定指數（instabilityindex，Ⅱ）為31.56，說明GfHXT2 蛋白較為穩定。該蛋白的氨基酸組成情況詳見圖1。

圖1 GfHXT2 蛋白質的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of GfHXT2 protein

如圖1世紀，GfHXT2 蛋白包含20 種氨基酸，其中亮氨酸占11.2%，甘氨酸占10.2%，異亮氨酸占8.1%，絲氨酸占7.5%，丙氨酸占7.3%，纈氨酸占7.1%，蘇氨酸占6.2%，苯丙氨酸占5.8%，精氨酸和谷氨酸均占5%，脯氨酸占4.8%，天冬氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸均占3.1%，天冬酰胺占2.9%，賴氨酸、蛋氨酸以及色氨酸均占2.5%，組氨酸占1.7%，半胱氨酸含量最少僅占0.4%。

2.2 GfHXT2 蛋白的親/疏水性預測結果

用ProtScale 軟件對GfHXT2 蛋白的親/疏水性進行預測，詳細情況見圖2。

圖2 蛋白親/疏水性分析Fig.2 Protein hydrophilicity and hydrophobicity analysis

如圖2世紀，GfHXT2 蛋白的整個肽鏈中均含有親水性或疏水性的氨基酸，在第410 和第411 氨基酸處得分最高，為3.056；在第461 氨基酸處得分最低，為-2.678。通過蛋白質親水和疏水的得分，結合理化性質分析結果，判斷GfHXT2 蛋白為結構較穩定的親水蛋白。

2.3 GfHXT2 蛋白信號肽預測及亞細胞定位分析結果

信號肽在重組蛋白的轉運和分泌方面作用顯著，具有介導蛋白質轉運、平衡蛋白質轉運和翻譯速度的功能，一般位于蛋白質的N 端，長約5～30 個氨基酸，包含信號肽的C 端、N 端和疏水核心區[32-33]。通過SignalP 5.0 軟件，依據剪切位置前的信號肽分值高來預測GfHXT2 蛋白的氨基酸序列中是否存在潛在的信號肽剪切位點，檢測結果詳見圖3。

圖3 GfHXT2 蛋白保守序列分析Fig.3 Conserved sequence analysis of GfHXT2 protein

如圖3世紀，信號肽分值（signal peptide score）為0.002 4，因此判斷GfHXT2 蛋白不含信號肽。通過PSORTⅡserver 軟件對GfHXT2 蛋白進行亞細胞定位分析，結果表明其分布在內質網的概率為55.6%，分布在分泌系統囊泡、高爾基體、線粒體和液泡的概率均為11.1%。

2.4 GfHXT2 蛋白跨膜螺旋結構預測結果

含有跨膜域的蛋白質可能是定位于膜的蛋白或者離子通道蛋白，也可能是膜受體蛋白。可通過在線軟件TMHMM，將測到的跨膜區以紅色標出，并預測出具體的位置，預測結果詳見圖4。

圖4 GfHXT2 蛋白的跨膜結構域預測Fig.4 Transmembrane domain prediction of GfHXT2 protein

如圖4世紀，紫色矩形為跨膜螺旋結構，藍色線段是膜內結構，黃色線段是位于膜外的結構。GfHXT2 蛋白包含481 個氨基酸，跨膜螺旋殘基數量的期望值約為212.62，說明可能含跨膜螺旋結構，N-term 位于膜細胞質側的總概率為58.7%。通過TMHMM 2.0 程序預測出10 個跨膜螺旋區，位置分別在第25～44、第54～76、第83～101、第111～130、第134～165、第268～290、第297～319、第343～365、第377～399、第403～425 氨基酸上。

2.5 GfHXT2 蛋白保守結構域預測結果

通過NCBI-CDD 軟件對GfHXT2 蛋白的保守序列及蛋白家族進行預測，結果詳見圖5。

圖5 GfHXT2 蛋白的保守結構域預測Fig.5 Conserved domain prediction of GfHXT2 protein

由圖5 可知，GfHXT2 屬于MFS 基因家族的HXT 亞家族，且都具有相似的結構[34]。第172～230氨基酸之間的區域為HXT 家族的保守結構域。

2.6 GfHXT2 蛋白的二級、三級結構預測結果

用SOPMA 對GfHXT2 的二級結構進行預測，結果詳見圖6。

圖6 GfHXT2 蛋白的二級結構預測Fig.6 Secondary structure prediction of GfHXT2 protein

由圖6 可知，GfHXT2 蛋白由481 個氨基酸組成，包含4 種形態，分別為α 螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β 轉角。其中有205 個氨基酸可能會形成α 螺旋（alpha helix），占42.62%；157 個氨基酸可能形成無規則卷曲（random coil），占32.64%；96 個氨基酸可能形成延伸鏈（extended strand），占19.96%；23 個氨基酸可能形成β 轉角（beta turn），占4.78%。無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結構。

利用SWISS-MODEL 對GfHXT2 蛋白進行三級結構的預測和模型構建，結果詳見圖7。

圖7 GfHXT2 蛋白的三級結構預測Fig.7 Tertiary structure prediction of GfHXT2 protein

由圖7 可知，GfHXT2 蛋白的三級結構預測結果與二級結構預測結果一致，α 螺旋可能形成無規則卷曲。

2.7 蛋白修飾位點的預測結果

通過NetNGlyc 1.0 Server 軟件對GfHXT2 的N端糖基化位點進行預測，結果詳見圖8。

圖8 GfHXT2 蛋白的N 端糖基化位點Fig.8 N-terminal glycosylation site of GfHXT2 protein

由圖8 可知，GfHXT2 蛋白共存在4 個N 端糖基化位點，分別位于第31、第96、第260、第369氨基酸位置處。通過NetOGlyc 4.0 Server 平臺對GfHXT2 的O 糖基化位點進行預測，結果顯示其含有3 個O 端糖基化位點，分別位于第22、第26、第108 氨基酸處。

2.8 GfHXT2 蛋白絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點的預測結果

使用NetPhos 3.1 Server 平臺對GfHXT2 蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點進行預測，結果詳見圖9。

圖9 GfHXT2 蛋白絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點Fig.9 Serine,threonine and tyrosine phosphate sites of GfHXT2 protein

由圖9 可知，3 種氨基酸共有磷酸化位點44個，其中絲氨酸（Serine）有27 個磷酸位點，分別在第19、20、21、24、28、45、53、58、74、127、142、159、167、178、224、267、279、298、337、352、354、393、401、433、443、456、467 氨基酸處；蘇氨酸（Threonine）有17 個磷酸位點，分別在第44、65、69、71、134、174、218、233、257、264、265、283、301、326、332、390、452 氨基酸處；不含有酪氨酸（Tyrosine）磷酸位點。根據上文可知，GfHXT2 蛋白較為穩定，說明絲氨酸的27 個磷酸化位點可以提高該結構的穩定性[35]。

2.9 蛋白交互網絡分析結果

通過STRING 對蛋白進行交互網絡分析，結果詳見圖10。亞單位β-2（SIP2）、含WD 重復序列的蛋白（mip1）、非特征蛋白質（A0A1C7M1M4）、5'-腺苷酸激活的蛋白激酶亞單位γ（cbs2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ATG1）、含DUF1752 結構域的蛋白質（A0A1C7MAL7）、PHO 系統的負調節器（PHO85）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ssp1）和cAMP 依賴性蛋白激酶調節亞單位（PKAR）。存在48 條互作關系，線段表示互相物理接觸或在功能上有關的蛋白質通過復雜的相互作用連接[36]。

圖10 GfHXT2 蛋白交互網絡分析Fig.10 Analysis of GfHXT2 proteininteractive network

3 結論與討論

如圖10世紀，線段的顏色表示互作類型，線條粗細表示互作的強度。結果顯示有13 個蛋白質與GfHXT2 蛋白互作，即：非特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（SNF1）、高親和力葡萄糖轉運蛋白（ght2）、推測的葡萄糖轉運蛋白（rco-3_1）、SNF1 蛋白激酶

HXT 亞家族屬于膜轉運蛋白主要促進劑超家族（MFS）。MFS 蛋白被認為是通過1 個單一的底物結合位點發揮作用，交替進入機制涉及搖桿開關類型的運動。真菌己糖轉運蛋白（HXT）亞家族由功能冗余蛋白質組成，主要在葡萄糖、半乳糖、果糖等的轉運中起作用。而灰樹花具有多種生理功能，其主要生物活性成分是多糖類物質。因此研究己糖轉運蛋白HXT2 具有較高的生物學價值，可以通過改變編碼HXT2 的基因影響葡萄糖、半乳糖、果糖等糖的轉運，進而改變灰樹花多糖含量，以期提高灰樹花多糖的生物學功能。

目前對于食用菌的研究主要集中在多糖的生物學功能和藥用價值方面，針對灰樹花己糖轉運蛋白方面的研究較少。有研究結果表明HXT2 是中度親和的轉運子，易被低濃度葡萄糖誘導，而被高濃度葡萄糖所抑制[37-38]。HXT2 的編碼基因敲除試驗發現發酵的起始時間延遲，這意味著HXT2 在調節生長起始過程中發揮作用[39]。因此后續可以通過在實驗室進行高親和力轉運子基因克隆，使具有己糖運輸能力的基因高效表達。