溫度脅迫對黑木耳菌絲相關酶活性的影響*

劉巖巖，李 紅，王 紅，趙玉梅，曹 君，劉 賀，劉俊杰**

（1.遼寧省農業科學院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161；2.撫順市先進裝備制造業發展促進中心，遼寧 撫順 113000；3.撫順市現代農業及扶貧開發促進中心，遼寧 撫順 113000）

黑木耳（Auricularia auricularia）隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariale）木耳屬（Auricularia）[1]，屬于中溫型菌類。其營養豐富，含有人體所需的鐵、鈣、蛋白質、維生素、碳水化合物、粗纖維等營養物質[2]，不僅具有食用價值，還有較高的藥用價值。中醫認為黑木耳具有清肺、益氣、治療痔瘡的功效，早在《本草綱目》中就有記載木耳性平、味甘，輕身強志，益氣不饑。現已有研究證明，黑木耳粉對因二氧化硅粉塵吸入導致的矽肺病有一定的抑制作用。黑木耳多糖有抑菌、抗氧化、預防心血管相關疾病等多種醫藥功效[3]。

中國為全球黑木耳栽培、出口第一大國，栽培量占全世界的95%以上[4]。黑木耳栽培方法受地域、氣候等因素影響而有不同，獲得的子實體在品質和產量上也存在較大差異。目前，國內大面積人工栽培的黑木耳，大多采用袋料式栽培，此種方式因栽培周期短、產量高而優勢突出，現已成為其人工栽培的主要方式。在食用菌生長發育過程中因光照、溫度、濕度等環境因素不同，其品質和產量會受到影響[5]。黑木耳是中溫型食用菌品種，菌絲體在5～35 ℃條件下均可以正常生長[6]。

利用人工袋料栽培黑木耳雖然歷史較長、經驗豐富，但由于栽培者技術水平和管理理念的不同，導致獲得的收益千差萬別。全光照露地栽培管理方式較為傳統，由于目前還不能實現精準化管控，栽培期間常出現菌包燒熱等現象，導致菌絲體生理及子實體農藝性狀發生改變，影響黑木耳的產量和品質。劉秀明等[7]在溫度脅迫12 h 和24 h 內，對白靈側耳[Pleurotus nebrodensis（Inzenga）Quél.]菌絲中3 種保護酶的活性進行檢測時發現，超氧化物歧化酶SOD（Super oxide dismutase，SOD）和過氧化物酶POD（Peroxidaseoxide dismutase，POD）活性迅速提高，隨后下降；在整個脅迫過程中過氧化氫酶CAT（Catalase，CAT）活性一直處于較高水平。閆靜等[8]對秀珍菇（Pleurotus geesteranus）的研究發現，在同一溫度條件下，隨著菌絲培養時間的延長，胞外羧甲基纖維素酶CMC（Carboxymethyl cellulase，CMC）、半纖維素酶（Hemicellulases）、濾紙纖維素酶FPA（FibrinopepideA，FPA）和淀粉酶AMY（Amylase，AMY）4 種胞外酶活性增強，而胞外漆酶LC（Laccases，LC）活性有所下降。處理溫度越低，漆酶活性越低，胞外5 種酶的活性總體呈先升后降的趨勢。韓增華等[9]發現不同品種的黑木耳菌種中漆酶和多酚氧化酶PPO（Polyphenol oxidase，PPO）活性的變化趨勢大致相同，酶活性變化與產量呈正相關。不同種類的食用菌，菌落形態不相同，菌絲在受到高溫脅迫后，應激反應也不相同[10]。

上述研究證明，在食用菌栽培過程中，溫度是影響食用菌生長發育的重要因素，不同食用菌品種或同種食用菌，不同生長時期對溫度的要求也不相同。不同溫度對食用菌酶活性的影響都是菌絲體適應環境的結果[11]，菌絲只有在適宜的溫度范圍內，才能進行正常的新陳代謝。包括食用菌在內的多種生物體，在高溫脅迫下，活性氧氧化生物膜會產生多種不飽和醛酮產物使蛋白質變性，并且破壞細胞膜的穩定性，對菌絲具有傷害作用，使其生理紊亂。

在生理學中高溫脅迫對生物產生的影響是非常重要的研究課題。

通過對黑木耳菌株進行一定時間的高溫脅迫后，測定黑木耳營養生長期和生殖生長期菌絲中丙二醛MAD（malondialdehyde， MAD）的含量， SOD、PPO、CAT、谷胱甘肽還原酶GR（glutathione reductase，GR）等的活性及子實體的農藝性狀，探討黑木耳對溫度脅迫的生理反應，為溫度控制、品種選育和栽培技術標準的制定提供技術手段和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及來源供試菌種黑木耳“沈8-9”，為遼寧省主栽品種之一，由遼寧省農業科學院食用菌研究所保藏。

1.1.2 培養基

PDA 培養基：200 g 馬鈴薯、20 g 葡萄糖、3 g磷酸二氫鉀、1.5 g 蛋白胨、1.5 g 硫酸鎂、15 g 瓊脂粉、1 000 mL 純凈水，pH 自然。

液體培養基：200 g 馬鈴薯、20 g 葡萄糖、3 g磷酸二氫鉀、1.5 g 蛋白胨、1.5 g 硫酸鎂、1 000 mL純凈水，pH 自然。

栽培袋培養基：木屑85%、麥麩12%、石膏1%、豆面2%，pH 為7.5。

1.1.3 檢測試劑盒

MAD 含量檢測試劑盒和SOD、PPO、GR、CAT檢測試劑盒均購自蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將供試菌種黑木耳沈8-9 母種接種到PDA 平板培養基上，封口放置在25 ℃恒溫培養箱內培養，待菌絲長滿整個平板后取出。在無菌條件下，用接種鏟將培養好的菌絲轉接到液體培養瓶中，置于25 ℃恒溫培養箱內靜置12 h 后，在150 r·min-1、25 ℃條件下培養5～7 d。

1.2.2 栽培袋制作

按常規方法生產菌棒，使用16.5 cm×33 cm 的聚乙烯栽培袋裝袋，滅菌后的菌袋轉移至冷卻間，待菌袋溫度降到30 ℃以下時接種。接10 mL 液體原種到栽培袋中，接種200 棒，設3 個重復。將接種后的菌袋置于25 ℃環境下避光培養，直到菌絲長滿菌袋。分別在溫度為25 ℃和35 ℃的培養室內放置100 棒菌袋，培養12 h 后取出，進行正常出菇管理。

1.2.3 菌落形態觀察

取35 ℃脅迫12 h 后的菌絲轉接至PDA 培養基上，在25 ℃條件下培養，測定菌絲在平皿中的生長速度，同時與在25 ℃條件下培養的菌絲生長速度進行對比分析。

1.2.4 酶活測定

經高溫脅迫12 h 后，分別在耳芽期、出耳期隨機選取5 袋菌包，取耳芽或耳片，測定質量后分裝于1.5 mL 離心管中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存后，進行MAD 含量及SOD、PPO、GR、CAT 等抗性酶系活性的測定。

1.2.5 黑木耳農藝性狀觀測記錄

觀測記錄高溫處理后黑木耳菌株菌絲的現耳芽時間、耳片顏色、耳片厚度、耳片寬度、產量、出芽整齊度和污染率指標[12-13]。耳片性狀選取第1 潮30 朵鮮耳進行測定。耳片厚度、寬度用游標卡尺以“十”字形進行測量，記錄子實體顏色的深淺。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征

不同溫度處理下黑木耳菌絲生長情況見表1 和圖1。

圖1 不同溫度處理后菌絲的生長情況Fig.1 Growth situation of hypha after different temperatures

表1 不同溫度處理黑木耳菌絲生長情況Tab.1 Growth situation of mycelium of Auricularia auricularia at different temperatures

由表1、圖1 可知，菌絲回接到PDA 培養基后，25 ℃條件下培養的黑木耳菌絲潔白、致密，長勢均勻，邊緣整齊，生長速度為3.531 mm·d-1。35 ℃脅迫12 h 后的黑木耳菌絲呈乳黃色，菌絲稀疏，邊緣整齊度差，生長速度為2.555 mm·d-1。

2.2 高溫脅迫對MAD 含量的影響

高溫脅迫對MAD 含量的影響見圖2。

圖2 不同溫度條件下黑木耳菌絲中MAD 的含量Fig.2 MAD contet of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖2 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中MAD 的含量為23.59 nmol·g-1，比對照組（25 ℃處理組）高3.46 nmol·g-1，而耳芽期和耳片期的MAD 含量處于低表達量水平，且受高溫脅迫影響不顯著。

2.3 高溫脅迫對SOD 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲中SOD 的活性見圖3。

圖3 不同溫度條件下黑木耳菌絲中SOD 的活性Fig.3 SOD activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖3 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中SOD 活性從30.61 U·g-1下降到14.97 U·g-1，下降了48.68%。隨著菌包中菌絲的自然恢復，耳芽期高溫脅迫后菌絲中SOD 的活性為CK 組的75.44%，含量提升了26.76%；耳片期高溫脅迫后菌絲中SOD 的活性為CK 組的78.40%，含量分別比菌包期和耳芽期提升了29.72%和2.96%。結果表明，高溫脅迫后黑木耳菌絲中SOD 的活性迅速下降，而到耳芽期和耳片期時，SOD 活性高于CK，有所提升。

2.4 高溫脅迫對PPO 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲的PPO 活性見圖4。

圖4 不同溫度條件下黑木耳菌絲的PPO 活性Fig.4 PPO activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖4 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，菌絲中PPO 的活性為60.80 U·g-1，是CK 的1.43倍，菌包期的處理對耳芽期和耳片期PPO 的活性無顯著影響，整體活性水平在20～22.8 U·g-1。

2.5 高溫脅迫對CAT 活性的影響

不同溫度條件黑木耳菌絲中CAT 的活性見圖5。

圖5 不同溫度條件黑木耳菌絲中CAT 的活性Fig.5 CAT activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖5 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，CAT 活性未發生明顯變化，為16.572 μmol·min-1·g-1，而CK 中CAT 的活性為16.442 μmol·min-1·g-1。當生長發育到耳芽期和耳片期時，CAT 活性均低于CK，其中耳芽期CAT 活性最低，為6.45 μmol·min-1·g-1，僅為CK 組的37.65%。

2.6 高溫脅迫對GR 活性的影響

不同溫度條件下黑木耳菌絲的GR 活性見圖6。

圖6 不同溫度條件下黑木耳菌絲中GR 的活性Fig.6 GR activity of Auricularia auricularia mycelium under different temperature conditions

由圖6 可以看出，35 ℃高溫脅迫菌包12 h 后，黑木耳菌絲中GR 活性為250.84 nmol·min-1·g-1，是CK組的8.29 倍。耳芽期和耳片期GR 的活性為10.72～16.08 nmol·min-1·g-1，對照組和處理組差異不顯著。

2.7 高溫脅迫對黑木耳農藝性狀的影響

不同溫度處理后黑木耳子實體農藝學性狀見表2。

表2 不同溫度處理黑木耳子實體農藝性狀Tab.2 Agronomic characters of Auricularia auricularia fruiting body under different temperature conditions

從表2 可以看出，在35 ℃條件下，黑木耳耳芽形成的時間比CK 組晚2 d，耳片較薄，耳片顏色差異不明顯，耳片比對照組寬1.452 cm，可能是受高溫脅迫后該品種朵形發生了變化。高溫脅迫后的菌包不但產量比對照組低4.87 g，污染率更是達到15%。說明高溫條件下，菌絲的活力會受到影響，其抗病能力也大大減弱，易受污染。

3 結論與討論

研究表明，黑木耳“沈8-9”對高溫脅迫較為敏感。菌絲體在受高溫脅迫后，其形態及顯微結構都出現變化。在溫度不適宜的條件下，黑木耳菌絲體的生長速度、色澤、長勢等都存在差異。35 ℃條件下高溫脅迫12 h，菌包培養期、耳芽期和出耳期3 個不同時期菌絲中多種酶的活性變化都大于25 ℃。其中SOD 活性在培養期迅速下降，但在整個生長期內，活性不斷增強；MAD 含量和PPO、CAT、GR活性變化明顯，且在耳芽期和耳片期活性處于較低水平，但受高溫脅迫持續影響不顯著。

高溫脅迫后，菌包培養期MAD 含量升高，抗性酶系活性升高或降低，是黑木耳菌絲自身抵抗外界脅迫產生的應激反應。MAD 是菌絲細胞膜系統受到損傷后產生的最終產物，其含量多少反映細胞膜的受損程度。抗性酶系活性的變化是由于菌絲將細胞內形成的過氧化物轉化為低毒或無毒物質，以維持體內活性氧的代謝平衡。耳芽期和耳片期是菌絲從營養生長轉變到生殖生長的時期，菌包培養期受高溫脅迫對這2 個時期的影響較弱。

在催芽過程中，各處理間耳芽形成時間和整齊度無顯著變化。頭潮耳采收時間較早的是25 ℃處理的菌棒，35 ℃處理組的采收時間最晚。耳芽的整齊度與菌絲是否受溫度脅迫無直接的相關性，這可能是因為黑木耳在催芽期的整齊度與環境濕度有關，栽培袋所處的位置通風好、濕度小，導致耳芽不整齊。

從栽培試驗可以看出，栽培袋刺孔后所處的溫度條件不同會直接影響木耳的產量和商品性狀。在25 ℃條件下，耳片的農藝性狀無顯著變化；35 ℃條件已經對黑木耳菌絲體活力造成影響，不但產量降低、商品性狀下降，污染率也大大增加。試驗結果顯示，高溫脅迫使SOD 活性在初期迅速降低，后期活性不斷增強，表明其一直在修復自身的活性損傷。結合產量及耳片相關農藝性狀的變化總結得出，溫度的變化影響菌絲生長過程中相關酶的活性，活性與受脅迫時間無正相關關系。在栽培過程中，不同溫度及脅迫時間對產量、污染率等農業性狀變化有直接關系，溫度越高且脅迫時間越長，產品品質及產量越低。