應用酶制劑進行木薯發酵乙醇的工藝優化研究

尚紅巖，程燕琳，2，劉俊敏，2，江雪晶，鄧毛程*，陳秀麗，吳曼亞，曾艷

(1.廣東輕工職業技術學院食品與生物技術學院，廣東廣州 510300；2.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303；3.廣東省科學院南繁種業研究所，廣東廣州 510316)

木薯作為一種非糧經濟作物，種植面積廣，是全球發酵酒精使用最廣原料之一,以木薯生產燃料乙醇將迎來巨大的發展機遇[1]。美國到2022 年，可再生能源的比例將達到新高峰，例如生物乙醇1.363×1011升。2015 年，歐盟推行的生物乙醇計劃占到了5 %的市場份額，2020 年進一步增加到10 %[2]。我國2020 年要在全國范圍內推廣使用車用乙醇汽油，基本實現全覆蓋，因此燃料乙醇的生產狀況對車用乙醇汽油的推廣具有十分重要的意義[3]。

木薯淀粉含量高，木薯原料發酵生產乙醇是一個復雜的系統工程，包括蒸煮糊化、液化、糖化和發酵等階段，需要淀粉酶和糖化酶的酶解，這是目前常用雙酶法工藝。木薯中除了含有淀粉還含果膠質等大分子物質，果膠是一種多糖，加水后以不穩定的膠體狀態存在于醪液中，使醪液粘性增加，還會附著在活性材料的表面，阻止酶類與淀粉原料接觸，降低原料糖化發酵的效率。發酵前加入果膠酶，將果膠水解為小分子糖，有利于提高酶解和發酵率[4]。酶制劑應用能夠優化乙醇的生產工藝，提高產品質量和生產效率。乙醇的工藝優化也將帶動酶制劑的開發與應用[5]。本研究以木薯粉為原料，通過單因素實驗和正交實驗對液化工藝進行優化；通過添加果膠酶，研究對木薯糖化和發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

木薯粉，市售；耐高溫α-淀粉酶20000 U/g，糖化酶150000 U/g，果膠酶100000 U/g，廣州瑟燁生物科技有限公司；釀酒活性干酵母，廣西丹寶利酵母有限公司。

試劑及耗材：碘液、濃硫酸、酚酞、氫氧化鈉、尿素等均為分析純，廣州化學試劑廠。

儀器設備：UV-520 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；PHS-3 精密酸度計，上海大普儀器有限公司；FA224 電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋，鄭州長城可供貿有限公司；98-1-C 數顯控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；YX-280 型手提壓力蒸汽滅菌鍋，廣州越特科學儀器有限公司；101-3AB 型電熱鼓風干燥箱、DHP-9162 電熱恒溫培養箱，上海恒科科學儀器有限公司；酒精濃度計，河北省武強縣同輝儀表廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 木薯發酵酒精工藝流程（圖1）

圖1 木薯發酵酒精工藝

1.2.2 木薯液化工藝單因素條件研究

(1)調漿：稱取木薯粉加水調漿，為考察料液比對發酵酒精的影響，分別選擇1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的料液比，加入耐高溫ɑ-淀粉酶50 U/g，設置液化溫度105 ℃，液化時間60 min，研究不同料液比對木薯粉液化效果和發酵的影響。

(2)液化：將木薯粉按1∶2.5 的料液比例加水調漿，pH 調至6.0～6.5，加入耐高溫ɑ-淀粉酶50 U/g，攪拌搖勻，研究不同液化溫度（95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃）和液化時間（45 min、60 min、75 min、90 min）對木薯液化效果和發酵酒精濃度的影響，液化結束后加入碘液，如無顯色反應即液化完成，記錄碘液檢驗的顏色。

(3)糖化：液化結束，液化液冷卻至60 ℃后補水至原體積，加入10 %硫酸將pH 調至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，放置到58～62 ℃水浴鍋中糖化60 min。糖化結束后降溫至32 ℃。

(4)發酵：稱取0.8%活性干酵母（糖化液重量），加到10 倍的32 ℃無菌水中，攪拌溶解，復水活化10 min，加入糖化液中，31～33 ℃恒溫發酵72 h。

(5)發酵結束后，測定發酵液殘還原糖含量；對發酵液進行蒸餾，測定蒸餾酒液的酒精濃度。

1.2.3 木薯液化工藝正交實驗優化

為了進一步優化木薯淀粉液化工藝條件，在單因素實驗的基礎上，設計正交實驗。選擇液化料液比、液化溫度和液化時間三個因素作正交試驗，試驗因素和水平見表1。以發酵成熟醪液殘還原糖和酒精含量做評價指標。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.4 果膠酶對木薯淀粉糖化和發酵的影響

果膠是以半乳糖醛酸為主的復合多糖類物質，加水拌料后以膠體形式存在于醪液中，使醪液粘度增大，在果膠酶作用下果膠會水解生成低分子量的半乳糖醛酸，降低醪液黏度。按步驟1.2.2 優化后液化工藝液化木薯淀粉，液化結束后冷卻至60 ℃后補水至原體積，加入10 %硫酸將pH 調至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，分別添加果膠酶50 U/g、75 U/g、100 U/g、125 U/g，混勻后在58～62 ℃水浴鍋中糖化60 min，然后降溫至32 ℃，接種0.8 %活性干酵母，恒溫發酵時間為72 h。發酵結束后測定發酵液殘還原糖，對發酵液進行蒸餾，測定蒸餾酒液的酒精濃度。

1.2.5 檢測方法

木薯粉液化液結果檢驗[6]：碘液檢驗，淀粉的存在與否可以用碘液檢查，淀粉具有在碘液中變藍的特性。

酒精度的測定：蒸餾-酒度計法，量筒量取100 mL發酵液，放入蒸餾燒瓶內，用100 mL 蒸餾水沖洗量筒，放入蒸餾燒瓶內，蒸餾并收集餾出液100 mL，用酒度計測定餾出液酒精濃度。

外觀糖度的測定：糖錘度計法。

總糖、還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS 法)[7]。

1.2.6 數據處理與分析

每組實驗重復3 次，實驗結果取平均值，用Ex‐cel 軟件對實驗數據進行統計和繪圖，SPSS 19.0 進行正交實驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同料液比對液化條件的影響

木薯粉生產酒精需要加水調漿，料液比（加水量）是非常重要的參數，加水量過多，會使最終發酵酒精含量低，增加酒精蒸餾能耗；加水量過少，會使醪液黏度大，影響醪液的混合、輸送、加熱和冷卻等，進一步影響液化和發酵效果。木薯粉以不同料液比配料后液化和發酵的實驗結果見表2。

表2 不同料液比對液化條件的影響

由表2 可知，隨著料液比的變化，發酵醪液酒精濃度呈現上升的趨勢，殘還原糖含量相應降低，當料液比1∶2.5 時，酒精濃度最高達到12.13 %vol，殘還原糖的含量最低；料液比1∶3.0 時，酒精濃度降低，殘還原糖含量增高；當料液比1∶3.5 達到酒精濃度最低值。綜合分析表明，料液比在1∶2.5 時，酒精發酵效果最佳。

2.2 不同液化溫度對發酵酒精的影響

溫度是液化過程中最重要的因素之一，不僅影響反應速度，也影響ɑ-淀粉酶的活性。提高溫度可以提高反應速度，加速酶的反應效率，提高溫度和降低反應速度會導致酶蛋白逐漸變性，導致酶的反應效率降低甚至失活。本實驗使用的耐高溫ɑ-淀粉酶，宜在95 ℃以上液化，為此考察了95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃4 個溫度對液化的影響，所得結果如表3 所示。耐高溫α-淀粉酶在液化溫度較低時液化淀粉的能力相對于高溫時液化能力弱，酒精發酵酒精濃度隨著溫度的升高而升高，液化溫度105 ℃左右液化效果較好，發酵酒精濃度可達12.29 %vol，液化溫度110 ℃和105 ℃時發酵酒精濃度相近，出于節能考慮，選擇相對最優液化溫度為105 ℃。

表3 不同液化溫度對發酵酒精的影響

2.3 不同液化時間對發酵酒精的影響

為了研究液化時間對發酵酒精的影響，液化時間分別設定為45 min、60 min、75 min、90 min，液化后進行碘檢試驗，用碘檢試驗后的顏色和酒精濃度評價液化的完成情況，結果見表4。

表4 不同液化時間對發酵酒精的影響

表5 液化實驗正交實驗L9(33)結果

由表4 可以看出，液化時間在60 min 時，酒精濃度最高，發酵效率最好；液化時間在45 min 時，碘檢結果不達標，液化不完全；當液化時間由60 min延長至75 min 后，酒精濃度下降。原料液化時間不充分會形成生料，導致整個發酵過程中染菌；如果液化時間過長同樣會影響發酵效果，影響出酒率。實驗結果表明，液化時間以60 min 為最佳，所以，確定最佳的液化時間為60 min。

2.4 木薯粉發酵酒精液化正交實驗影響

木薯液化三因素三水平正交試驗L9(3)3結果見表5。由實驗結果可知，按照極差R 大小確定的因子影響主次順序為：料液比＞液化溫度＞液化時間，以酒精濃度為主要評價指標，最好的工藝參數配合水平為A2B2C1，即料液比1∶2.5，液化溫度為105 ℃，液化時間為60 min。用最優因素組合A2B2C1進行驗證試驗，發酵液酒精度達到12.58 %vol，殘還原糖為0.33 %。高于正交表中最高酒精濃度12.49 %vol，液化和發酵效果相對最好。

2.5 果膠酶對木薯發酵酒精的影響

2.5.1 果膠酶的添加方法

果膠是以半乳糖醛酸為主的復合多糖類物質，果膠酶通過水解作用切斷果膠分子的α-1,4糖苷鍵，將果膠降解釋放還原性末端，使果膠黏度降低[8]，可有效降低發酵醪液黏度，增加可發酵糖的含量。

2.5.2 果膠酶不同添加量對木薯發酵酒精的影響

添加不同濃度果膠酶對酒精發酵的酒精濃度影響，如圖2 所示。

圖2 果膠酶對酒精發酵的酒精濃度影響

從圖2 可知，在一定范圍內發酵酒精中的酒精濃度隨著果膠酶用量的增加而增大，用量從0到75 U/g，酒精濃度有明顯變化，說明在此范圍內，增加果膠酶用量，提高酒精濃度效果顯著，繼續增加果膠酶用量時，酒精濃度呈現下降趨勢，說明繼續增加果膠酶用量對提高發酵酒精的優化工藝意義不大。從經濟以及效果優化考慮，75 U/g 果膠酶的添加量為較合適果膠酶用量。

添加果膠酶對酒精發酵相關指標的影響，如表6 所示。

表6 果膠酶對酒精發酵的相關指標影響

從表6 可知，隨著果膠酶用量從0 到75 U/g，酒精發酵后殘還原糖含量有明顯變化，殘還原糖降低，有利于酒精發酵；繼續增加果膠酶用量，殘糖含量增高，說明繼續增加果膠酶用量優化工藝意義不大，綜上相關指標研究，選取75 U/g 果膠酶添加量進行后期實驗。

3 結論

在木薯發酵酒精中，添加α-淀粉酶、糖化酶、果膠酶和優化液化工藝能顯著提高發酵液酒精含量。本文研究了木薯淀粉料液比、液化溫度和液化時間對淀粉液化效果和酒精發酵的影響。通過單因素試驗和正交實驗優化，以酒精濃度和殘糖作為評價指標，確定木薯粉液化的最佳料液比1∶2.5，液化溫度105 ℃，液化時間60 min，相應發酵酒精濃度為12.58 %vol，殘還原糖0.33 g/100 mL。在糖化過程中，考察了糖化酶和果膠酶對糖化發酵的影響，通過單因素實驗添加不同用量果膠酶考察了對木薯酒精發酵影響，以1∶2.5 的料液比進行配料，優化后的液化條件進行液化，加入10 %硫酸將料液pH調至4.2～4.5，設置溫度58～62 ℃，加入200 U/g糖化酶、75 U/g 果膠酶，水浴鍋中糖化60 min，接種0.8 %干酵母發酵，發酵成熟醪液還原糖含量最低為0.37 g/100 mL，酒精度最高達到14.40 %vol，遠高于不加果膠酶的發酵酒精濃度，木薯發酵酒精添加適量的果膠酶，對糖化和發酵影響顯著，可明顯提高發酵酒精濃度。