熊蜂成群與未成群蜂王體內氨基酸和脂肪酸含量的比較研究

何金明,孫智禹,牛慶生,劉玉玲,徐 凱

(吉林省養蜂科學研究所,吉林 132108)

蛋白質和脂類物質是生命體的主要組成物質,在昆蟲生長發育和繁殖方面發揮著重要的作用。相較于昆蟲的個體基本生存需求,其在繁殖階段對蛋白質和脂類的需求更大。關于動物的飼養試驗表明,日糧中添加氨基酸和脂類可提高昆蟲的繁殖能力(徐暢等, 2019)。棉象鼻蟲Elaeidobiuskamerunicus的人工飼料中必須添加氨基酸才能保障其正常發育和產卵(曾凡榮, 2018)。在桔小實蠅Bactroceradorsalis和昆士蘭實蠅Bactroceratryoni的日糧中添加脂肪酸能夠提高其羽化率、產卵量和卵孵化率(Changetal., 2010; Moadelietal., 2018)。此外,昆蟲的不同生理階段體內氨基酸和脂肪酸含量也會發生一定變化。如黑胸大蠊Periplanetafuliginosa在若蟲期和卵期的氨基酸含量存在較大差異(吳仕筠等, 2008)。黃褐油葫蘆Teleogryllusderelictus蟲體的脂肪酸含量隨著生長發育而逐漸增加,且其在不同階段(高齡若蟲、卵與低齡若蟲)間存在顯著差異(史樹森等, 2005)。比較昆蟲不同繁殖階段體內氨基酸和脂肪酸含量的差異,對探究昆蟲繁殖相關的營養物質代謝機制具有重要意義。

熊蜂Bombusspp.是多種野生植物和農作物重要的傳粉昆蟲,在維護生態平衡和促進農業增收方面發揮著重要作用(Arango-Diagoetal., 2020)。野生的熊蜂多為一年一個世代,其在早春時期結束冬眠后開始產卵,逐漸進入繁殖階段,子代蜂王交尾后會離群尋找新的越冬場地,而原群則在秋末迅速滅亡。野生熊蜂僅能為春末和夏季的作物進行授粉,為滿足冬季和早春設施作物的授粉需求,則必須通過工廠化繁育來打破其固有的繁育周期,實現周年繁育,繼而實現規?；曫B。熊蜂工廠化繁育主要包括了滯育、產卵、成群、子代繁育等重要環節,其中成群率低是制約我國實現本土熊蜂工廠化繁育的主要原因之一。成群是熊蜂從獨居性向社會性轉變的關鍵時期。許多研究將蜂王培育出10頭以上工蜂的蜂群定義為成群,表示該蜂群具有鮮明的社會分工,而到期卻未培育出10頭工蜂便停產的蜂群則被定義為未成群(Gosterit, 2016)。影響熊蜂成群的因素主要包括品種特性、營養代謝、飼養環境以及繁育方法等。但在熊蜂工廠化繁育中,繁育蜂種、飼養環境和繁育方法相對一致,蜂王體內營養物質代謝則成為決定熊蜂成群的主要因素。目前關于昆蟲不同繁殖階段生理指標測定的研究較少,更未見熊蜂成群階段蜂王體內營養物質代謝的相關報道。本研究通過測定熊蜂成群與未成群蜂王體內氨基酸和脂肪酸種類及含量,探究兩個不同繁殖狀態下蜂王體內氨基酸和脂肪酸含量的差異,以期闡釋氨基酸和脂肪酸代謝對熊蜂成群的影響,并為工廠化繁育中熊蜂蜂王各繁育階段精準營養日糧的配制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用熊蜂均為吉林省養蜂科學研究所熊蜂擴繁基地的明亮熊蜂Bombuslucorum,采集的蜂王樣本均為同一批次,且飼養環境和繁育方法完全相同。蜂王產卵40 d后在飼養室中分別隨機選取成群蜂群(工蜂數量>10頭)的蜂王和未成群蜂群(工蜂數量<10頭)的蜂王各30頭,隨機分為3組(10頭/組)。采集后的蜂王經編號后立即投入液氮中,隨后保存于-80℃冰箱,用于后續氨基酸和脂肪酸含量的測定。

1.2 主要試劑與儀器

17種氨基酸標品均購自上海安譜實驗科技股份有限公司;乙腈、異硫氰酸苯酯、正己烷、三氟化硼甲醇均購自CNW;乙醚、石油醚、三乙胺等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司;35種脂肪酸混合標準品購自Sigma公司。

電子天平購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司(型號:舜宇恒平FA-1004)、離心機購自Thermo公司(型號:BR4I)、液相色譜儀購自Aglient公司(型號:1260)、氣相色譜儀質譜儀購自Thermo公司(型號:Trace1310 ISQ)。

1.3 不同繁殖狀態下熊蜂氨基酸、脂肪酸含量測定方法

分別對每個組的10頭熊蜂蜂王樣品進行混合研磨,并利用高效液相色譜法(HPLC法)和氣質聯用法(GC-MS)對熊蜂蜂王體內各氨基酸含量和脂肪酸含量分別進行測定。在測定樣品氨基酸組成及含量時,使用20 mL 1∶1 HCL對樣品進行前處理,110℃電熱鼓風干燥箱中水解22 h,冷卻后定容至25 mL。取50 μL樣品放入真空干燥箱中60℃干燥2 h后在離心管中充氮,加入50 μL衍生試劑后室溫衍生30 min,加入流動相A 4.5 mL后混勻,過0.45 μm有機膜上機。

在測定樣品脂肪酸組成及含量時,稱量適量樣品水解后提取脂肪,于100℃烘箱中干燥2 h。向脂肪提取物中加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液,85℃水浴30 min,加入3 mL 14% 三氟化硼甲醇溶液,85℃水浴30 min。水浴完成后,溫度降至室溫后加入1 mL正己烷,震蕩萃取2 min,靜置1 h。取上層清液100 μL,用正己烷定容到1 mL。用0.45 μm濾膜過膜后上機測試。

樣品測定由青島科創質量檢測有限公司完成。

1.4 數據處理

運用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析,并選用Tukey法進行多重比較,最終氨基酸和脂肪酸含量以平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 成群與未成群熊蜂蜂王體內氨基酸差異

2.1.1氨基酸組成

對熊蜂成群與未成群蜂王體內氨基酸組成進行測定,在待檢測的17種水解氨基酸中只檢測到16種氨基酸,未檢測出蛋氨酸(圖1)。成群和未成群蜂王體內含量最多的6種氨基酸均為谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸,且以上6種氨基酸含量總和超過了蜂王氨基酸總和的50%。在成群蜂王體內含量由高到低依次為谷氨酸>丙氨酸>亮氨酸>絲氨酸>天冬氨酸>蘇氨酸,但在未成群蜂王體內由高到低依次為谷氨酸>亮氨酸>丙氨酸>天冬氨酸>絲氨酸>蘇氨酸。

圖1 熊蜂成群(A)與未成群(B)蜂王體內氨基酸組成Fig.1 Amino acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)

2.1.2氨基酸含量

對成群和未成群熊蜂蜂王體內氨基酸含量進行測定,結果見表1。成群與未成群階段熊蜂蜂王體內13種氨基酸含量存在顯著差異,分別為天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絡氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸。在13種氨基酸中,除丙氨酸外,成群蜂王體內其他氨基酸的含量均顯著低于未成群蜂王(P<0.05)。經過比較不同生理階段熊蜂蜂王體內各氨基酸含量的差異幅度可發現,蜂王體內纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸的變化幅度最大,均高于14%。

表1 成群蜂王與未成群蜂王體內氨基酸含量比較

2.2 成群與未成群熊蜂蜂王體內脂肪酸差異

2.2.1脂肪酸組成

在待檢測的35種脂肪酸中蜂王體內僅檢測到17種脂肪酸,油酸C18∶1n9c、α-亞油酸C18∶3n3和亞油酸C18∶2n6c為蜂王占比最多的3種脂肪酸(圖2)。脂肪酸根據碳氫鏈中飽和程度,可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)。在熊蜂成群蜂王體內SFA、MUFA和PUFA的占比分別為14.16%、36.50%和49.34%。而在未成群蜂王體內SFA、MUFA和PUFA的占比分別為17.91%、39.66%和42.43%。

2.2.2脂肪酸含量

成群和未成群熊蜂蜂王體內脂肪酸含量見表2。成群與未成群階段熊蜂蜂王體內6種脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05),分別為辛酸、癸酸、月桂酸、亞油酸、順-11-二十烯酸、二十三酸。在6種脂肪酸中,未成群蜂王體內辛酸、癸酸、月桂酸的含量顯著高于成群蜂王,而成群蜂王體內亞油酸、順-11-二十烯酸、二十三酸顯著高于未成群蜂王。經過比較不同蜂王體內飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量可發現,成群蜂王體內多不飽和脂肪酸含量顯著高于未成群蜂王(P<0.05)。

3 結論與討論

熊蜂屬于亞社會性昆蟲,其蜂王滯育結束后獨自進行產卵和哺育幼蟲,至第一批工蜂(數量為8～16頭)羽化出房后,蜂王專職產卵,工蜂進行哺育和采集等活動(Goulson, 2009)。當蜂群內工蜂數量超過10頭時,該蜂群進入成群階段。成群意味著該蜂群完成了從獨居性向社會性的轉變,也是后續群勢增長、子代繁衍以及為作物授粉的前提條件。到一定時間后群勢仍未達到10頭工蜂的蜂群通常定義為未成群,熊蜂工廠化繁育中未成群的原因通常是由于蜂王的產卵能力和哺育能力較低所導致的(徐凱等, 2020)。本研究比較成群和未成群蜂王體內氨基酸和脂肪酸組成,發現成群和未成群蜂王體內各氨基酸和脂肪酸含量占比均存在較大差異,推測蜂王體內氨基酸和脂肪酸的代謝參與了熊蜂產卵、哺育等生殖活動,與Ghosh等研究結果相近(Ghoshetal., 2017)。

圖2 熊蜂成群(A)與未成群(B)蜂王體內脂肪酸組成Fig.2 Fatty acids composition of bumblebee queens in colony foundation success (A) and colony foundation failure (B)注:SFA,飽和脂肪酸;MUFA,單不飽和脂肪酸;PUFA,多不飽和脂肪酸。Note: SFA, Saturated fatty acids; MUFA, Monounsaturated fatty acids; PUFA, Polyunsaturated fatty acids.

表2 成群蜂王與未成群蜂王體內脂肪酸含量

氨基酸和脂肪酸分別作為蛋白質和脂質的基本組成單位,在昆蟲生長發育、生殖繁衍以及適應環境等生理過程中發揮著重要作用(Simpsonetal., 2012; 龍登隆等, 2021)。已有研究表明,一些功能性氨基酸和脂肪酸會影響動物的性腺發育、精卵質量、胚胎發育等繁殖性能(Wu, 2009; Zakerietal., 2011)。Hoedjes等(2017)研究表明日糧中功能性氨基酸對果蠅的壽命和生殖能力有直接影響。李興鵬等(2018)發現提高蠋蝽Armachinensis日糧中不飽和脂肪酸質量分數有助于4～5齡若蟲生長,并提升其成蟲的生殖能力。Ling等(2007)提高日糧中亞麻酸和亞油酸的質量分數后,果蠅的羽化率、產卵量和卵孵化率顯著增加。本研究在熊蜂蜂王體內分別檢測到16種氨基酸和17種脂肪酸,經比較后發現,在成群和未成群蜂王體內分別有13種氨基酸和6種脂肪酸含量存在顯著差異,推測蜂王體內氨基酸和脂肪酸參與了熊蜂的成群過程,與上述研究結果相一致。

氨基酸是昆蟲生長發育和繁殖所必須的營養元素,除了一些蚜蟲等刺吸式口器的昆蟲外,大多數昆蟲均先將蛋白質水解為氨基酸后由蟲體細胞吸收、循環,并再次合成肌肉、細胞膜、酶以及一些特殊的激素等需要的蛋白質(張楊等, 2021)。在果蠅的相關研究中發現,日糧中蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等必需氨基酸的添加能夠有效延長果蠅的壽命,并提高其繁殖力(Hoedjesetal., 2017)。Ghosh等(2017)比較熊蜂Bombusterrestris滯育期體內氨基酸含量后發現,熊蜂滯育前后蜂王體內賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸的含量降低,其余氨基酸含量上調。本研究中發現,熊蜂成群和未成群蜂王體內13種氨基酸含量存在顯著差異,且除丙氨酸外,其余氨基酸均為顯著下降,且纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸下降幅度較大。李方方等(2013)研究表明,日糧中的纈氨酸與賴氨酸可提高初產母豬的日采食量和產仔性能。陳熠等(2009)研究表明纈氨酸對泌乳母豬體內激素水平具有一定影響。Wu等(2005)對妊娠不同時期的母豬及胎兒液檢測后分析發現妊娠母豬體內脯氨酸含量與胎盤發育速度存在相關性。Kazuchika等(2014)研究發現甘氨酸對卵母細胞發育以及胚胎發育具有直接影響。成群蜂王體內纈氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸的大幅下降,推測熊蜂成群與蜂王采食量、卵母細胞發育、生殖激素分泌以及產卵性能密切相關。

脂肪酸是一類一端含有一個羧基的脂肪族碳氫鏈,參與昆蟲生長發育、激素分泌、生殖和抗寒等多項生理活動(鄭天祥等, 2017)。脂肪酸一般分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。研究表明,多不飽和脂肪酸通過合成類固醇激素進而影響動物的繁殖性能,不僅可以促進動物生殖器官的發育,還可以提高其排卵率和產仔率(王懷禹, 2011)。本研究中成群階段蜂王體內多不飽和脂肪酸顯著高于未成群蜂王,推測多不飽和脂肪酸在提高蜂王卵巢功能和促進產卵方面發揮著重要作用(Vrabliketal., 2013)。辛酸C8∶0、癸酸C10∶0和月桂酸C12∶0均屬于中鏈脂肪酸,比長鏈脂肪酸更易被動物吸收,具有迅速供能作用。本研究發現成群蜂王體內辛酸、癸酸和月桂酸均顯著低于未成群蜂王,推測在熊蜂成群過程中大量的中鏈脂肪酸被腸道所吸收,用以產卵和哺育幼蟲時的部分能量來源(袁愛雲, 2021)。此外,中鏈脂肪酸還具有調節動物腸道形態、抑制有害菌增殖、調節免疫功能以及促進動物的生長性能等功能,蜂王體內中鏈脂肪酸的代謝也可增強蜂王免疫能力,利于熊蜂成群(Sundqvistetal., 2018)。吳洪號等(2021)研究表明ω-6(包含亞油酸)類脂肪酸能夠調節生長激素和催乳素的分泌。Holman等(2019)對社會性昆蟲蜂王信息素進行轉錄組分析后發現蜂王信息素合成相關基因富集于長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸合成的分子通路。此外,大量的研究也表明,長鏈脂肪酸也是蜂王物質表皮碳氫化合物CHCs的組成成分(Oldhametal., 2010)。本研究發現成群蜂王體內長鏈脂肪酸(C23∶0、C20∶1和C18∶2n6c)的含量顯著高于未成群蜂王,推測該3種脂肪酸在蜂王成群后機體合成蜂王物質和信息素中發揮著重要作用。

本研究結果表明,熊蜂成群和未成群蜂王體內氨基酸和脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05),熊蜂蜂王成群率低可能與蜂王體內蛋白質和脂類代謝異常有關?；诖搜芯拷Y果,在實際的熊蜂工廠化繁育過程中,應挑選多種蛋白質含量高、富含多不飽和脂肪酸的新鮮蜂花粉混合后飼喂蜂群,并根據蜂群的不同繁育階段調整蜂花粉種類配比,最大限度保證蜂王較高的繁殖性能,提高熊蜂成群率。