基于植物DNA條形碼 rbcLa 序列的日本條螽食譜分析

王 慧,趙一錚,黃慧敏,周志軍

(河北大學生命科學學院,河北省動物系統學與應用重點實驗室,河北保定 071002)

植物與植食性昆蟲占據地球半數以上物種種類(Futuyma and Agrawal, 2009),是陸生生態系統中最重要的組成部分。綠色植物是生態系統中最重要的生產者(McClenaghanetal., 2015),為昆蟲提供食物、躲避天敵和繁衍生息的場所(Loaizaetal., 2008)。植物的防御行為與昆蟲的取食密切相關,植物進化出種類繁多的次生代謝產物,對昆蟲的食物選擇產生重要影響。同時,昆蟲也為植物運輸種子和傳遞花粉,被子植物的多樣性被認為與昆蟲的取食密切聯系。昆蟲形態及生活史變化可能是促使植物分化的重要動力(Marquis, 2004)。正如Ehrlich和Raven提出的植食性昆蟲與植物的相互作用,造就了現今陸地生物多樣性的產生。植物含有植食性昆蟲生長發育所需的全部營養物質,包括碳水化合物、氨基酸、甾醇、磷脂、脂肪酸、維生素、礦物質、微量元素和水等(Chapman, 1998; Schoonhovenetal., 2005)。

常用的植食性昆蟲食性分析方法包括:取食行為直接觀察法和腸道內容物及糞便顯微鑒定法。取食行為直接觀察法耗時費力,只能對少量個體的取食情況進行定性研究(Gordonetal., 1995);不適用于活動范圍較廣、夜行性或警覺性較高的昆蟲(Barnettetal., 2010; Bakeretal., 2014);對那些復雜環境中存在多種空間上不分離的潛在被取食對象,很難準確識別昆蟲取食的植物種類(Valentinietal., 2009)。鑒于上述缺陷,逐漸形成多種基于糞便或腸道內容物的食性分析方法(Moreno-Black, 1978; Van, 2000; 劉剛等, 2018):(1)顯微鑒定法(Microhistological method),對糞便或腸道內容物中的植物表皮碎片進行形態學顯微鑒定,對研究者形態學專業知識要求較高(Holecheketal., 1982; Mclnnisetal., 1983),對形態相似的近緣種鑒定效率較低;(2)飽和烷烴指紋法(Alkane fingerprint method),根據每種植物獨特的飽和烷烴濃度模式,能較好地分析和預測動物攝食量,但難以確定食物組成(Dove and Mayes, 1996);(3)近紅外反射光譜法(Near infrared spectroscopy, NIRS),通過掃描食性樣品的近紅外光譜得到食物的有機分子光譜特征,容易受顆粒大小和均勻性影響使分析結果產生偏差(Foleyetal., 1998; Kanekoetal., 2006)。上述幾種食性分析方法在進行定量分析時均存在一定偏差。

近年來,隨著植物DNA條形碼研究的深入,為有效鑒別植食性昆蟲取食的寄主植物種類、解析二者間的營養關系提供了新方法。目前,葉綠體matK、trnH-psbA以及rbcL組合被認為是理想的植物DNA條形碼選擇。Symes等(2019)以matK、trnH-psbA和rbcLa3個基因片段對螽斯食性進行了研究。DNA條形碼在植食性灶蟋Gryllodeshebraeus研究結果表明取食后12 h內消化道中的食物均可被檢測到(Mathesonetal., 2008)。H?ss等(1992)首次將葉綠體rbcl基因片段用于植食性動物食性分析。McClenaghan等(2015)利用葉綠體rbcLa基因片段比較了蝗科4種蝗蟲取食的植物種類。目前,葉綠體rbcL基因片段認可度最高,GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)數據庫收錄葉綠體rbcL基因序列287 752條(截止2021年11月1日);而BOLD(Barcode of Life Data System, http://www.boldsystems.org)數據庫則以葉綠體rbcL&matK序列作為植物分子鑒定的標準組合。

螽斯科是直翅目物種多樣性最高的科,作為鳴蟲具有重要的生態和經濟價值。對植食性螽斯取食的植物種類進行鑒定,不僅有助于了解其在生物群落中的功能(Duffyetal., 2007),而且對于豐富植食性昆蟲-植物間的協同進化理論具有重要意義。日本條螽Ducetiajaponica隸屬于直翅目Orthoptera螽斯科Tettigoniidae,廣泛分布于東洋界、澳洲界部分區域,在我國除西北部分地區外的多數地區均有分布(Ciglianoetal., 2021)。日本條螽存在棕色和綠色兩種色型,在野外常見于低矮喬木、灌木、草叢,在城區綠地大量發生。白天多隱藏在植物葉片背面或草叢中,傍晚爬至灌木上取食。Suetsugu和Tanaka(2014)發現日本條螽若蟲頻繁訪問并取食蘭科Habenariasagittifera花粉和花藥帽,認為可能存在直翅目-蘭花授粉互惠共生的進化途徑。目前,國內外學者已對日本條螽的鳴聲特征(楊培林等, 2000; 石福明等, 2003; Helleretal., 2017)、線粒體基因組序列(劉菲, 2017)、種群遺傳結構及譜系地理學(Zhouetal., 2021)進行了研究。為探明造就日本條螽地理分布格局及其能夠在城區綠地大量存在的原因,本研究利用葉綠體rbcLa基因片段對城區綠地和城郊荒地兩種生境中取食的植物種類進行了分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與腸道內容物DNA提取

本研究所用日本條螽標本于2021年8-9月夜晚(20∶00-22∶00)采集自河北保定城區軍校廣場、河北大學五四路校區、馬莊荒地(圖1)。采集到的日本條螽標本立即置于盛有足量無水酒精的凍存管中帶回實驗室。次日上午縱向剪開日本條螽腹壁,輕拉頭部取出完整消化道。縱向剪開消化道壁,收集內容物并在液氮中充分研磨。使用TIANGEN新型植物基因組提取試劑盒(DP320),依據操作說明進行DNA提取,并置于-20℃冰箱中保存備用。

圖1 日本條螽生境圖Fig.1 Habitus of Ducetia japonica 注:A,城區綠地;B,城郊荒地;C,夜晚采集標本照;D,標本生態照。Note: A, Urban green space; B, Suburban wasteland; C, Collecting specimen photos at night; D, Specimen ecological photos.

1.2 葉綠體 rbcLa 基因片段PCR擴增及測序

葉綠體rbcLa基因片段的擴增引物為:rbcLa-F(ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC)和rbcLa-R(GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG)(Symesetal., 2019)。PCR反應體系包括:2×Premix TaqTM25 μL、上下游引物各5 μL、DNA模板3 μL、超純水補足50 μL。反應條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環;72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送金唯智公司進行雙向測序。

1.3 測序結果拼接與數據庫搜索鑒定

雙向測序結果使用DNAstar軟件包中的SeqMan拼接。通過BOLD、Genbank數據庫進行同源搜索,以確定每個日本條螽樣本取食的植物種類。本研究最佳匹配序列與目標序列覆蓋度(Coverage)和一致度(Identity)均大于95%時認為檢索結果有效。鑒定原則參考邵昕寧等(2019)修改如下:(1)當BOLD和GenBank數據庫最佳匹配結果一致,且與單一物種比對一致度≥99%時,記為該物種;與多個物種比對一致度均≥99%時,記為涵蓋這些物種的最低分類單元。(2)比對一致度介于95%與99%之間,且符合物種分布記錄時,同樣記為該物種。(3)比對一致度介于95%與99%之間,但僅對應單一無分布記錄的物種;或比對一致度<95%時,認為無法確定具體種類,記為屬級未定種。(4)當兩個數據庫最佳匹配結果不一致時,首先根據采集點本底信息及物種分布記錄排除不符合物種;如果仍無法排除則記為涵蓋這些物種的最低分類單元。將軍校廣場和河北大學校園歸為城區綠地,馬莊歸為城郊荒地兩種生境進行比較。

2 結果與分析

2.1 日本條螽在城區綠地中取食的植物種類

從38頭采自城區綠地的日本條螽腸道內容物中成功擴增并測得葉綠體rbcLa基因序列,經鑒定發現日本條螽在城區綠地中取食的植物種類涵蓋6科7種,以18頭取食衛矛科Celastraceae的冬青衛矛Euonymusjaponicus占據優勢(47.37%)。其余20個個體由多至少依次為:茜草科Rubiaceae的茜草Rubiacordifolia(7頭),夾竹桃科Apocynaceae的鵝絨藤Cynanchumchinense(5頭),茜草科Rubiaceae的雞矢藤Paederiascandens(3頭),木樨科Oleaceae的迎春花Jasminumnudiflorum(2頭),大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens(2頭),薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa植物(1頭)(表1,圖2)。

2.2 日本條螽在城郊荒地中取食的植物種類

從37頭采自城郊荒地的日本條螽腸道內容物中成功擴增并測得葉綠體rbcLa基因序列,經鑒定發現日本條螽在城郊荒地中取食的植物種類涵蓋5科6種,以30頭取食大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens占據絕對優勢(81.08%)。其余7個個體由多至少依次為:唇形科Labiatae的紫蘇Perillafrutescens(3頭),葫蘆科Cucurbitaceae的南瓜Cucurbitamoschata(1頭)和絲瓜Luffaaegyptiaca(1頭),菊科Compositae的向日葵Helianthusannuus(1頭),黎科Chenopodiaceae的黎Chenopodiumalbum(1頭)(表2,圖2)。

續表1 Continued table 1

續表1 Continued table 1

表2 城郊荒地中日本條螽取食的植物種類

續表2 Continued table 2

圖2 城區綠地(A)和城郊荒地(B)中日本條螽的食物構成Fig.2 Diet composition of Ducetia japonica in urban green space (A) and suburban wasteland (B)

3 結論與討論

昆蟲食性分析時由糞便和腸道內容物中提取的DNA均存在一定程度的降解,并含有PCR抑制劑影響擴增和測序成功率(Bradleyetal., 2007)。Symes等(2019)研究發現3個植物DNA條形碼片段(rbcLa、psbA和matK)在前半夜(23∶00-01∶00)捕獲的體型較小的螽斯中擴增成功率較高;此外,螽斯腸道內容物顏色與擴增和測序成功率密切相關:無色+黃色+綠色+黃褐色組的成功率>30%,無色組的成功率約60%,棕色+橙色+紅色+綠棕色組的成功率極低。日本條螽為中型螽斯,腸道內容物為綠色。植食性動物在不同的棲息環境中,其食物的可獲得性和多樣性存在明顯不同(Cristo’bal-Azkarateetal., 2007)。日本條螽在兩種生境中取食的植物種類有一定的選擇性,但也與食物的可獲得性有關。城郊荒地的植物物種多樣性遠高于城區綠地,但其對取食植物的偏好更為明顯,81.08%的日本條螽個體取食大麻科的葎草。城區綠地中,除47.37%個體取食衛矛科的冬青衛矛外,取食其余6種植物的比例從2.63%至18.42%不等,偏好性并不明顯,可能是其適應城區綠地植物組成的結果。最佳覓食理論認為,動物在食物資源減少時,會逐步向泛食性轉變。

本研究通過對新采集的日本條螽腸道內容物進行DNA提取、rbcLa基因片段PCR擴增及測序,通過在GenBank和BOLD數據庫中進行搜索比對發現日本條螽至少取食10科、13種植物。結果表明,基于腸道內容物DNA進行植物DNA條形碼rbcLa基因片段擴增、測序,并利用GenBank、BOLD等公共數據庫資源可以對植食性昆蟲取食的植物種類進行快速鑒定和食性分析。GenBank數據庫中收錄的部分序列可能存在序列、對應物種信息錯誤。植物DNA條形碼研究為利用BOLD數據庫進行植食性昆蟲食性分析的效率和精度得到極大提升。同一條序列可能與多個物種高度匹配,在缺乏足夠的區域物種本底信息時,只能將其歸類為包含這些物種的上一級分類單元。通過構建本地潛在食源DNA條形碼rbcL序列數據庫可顯著提高食性分析時的分類精度。

昆蟲是城市生物多樣性的重要組成部分。探究城市化進程對城區昆蟲多樣性的影響,有助于更好地保護昆蟲多樣性。日本條螽能夠占據廣泛的分布范圍,并在城區綠地大量發生,可能與其廣譜的取食對象密切相關。為避免競爭,同域分布的近緣種可能會進化出不同的覓食策略,選擇不同的微生境或取食不同的食物。基于植物DNA條形碼的食性研究,為探究行蹤隱秘的植食性螽斯與棲息地植物間的協同進化關系提供了新的手段,有助于揭示近緣種的同域共存機制。