中華蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP4的分子特性及時空表達

李 強,劉 芳,趙紅霞*,趙俊星*

(1. 山西農業大學動物科學學院,山西太谷 030801;2. 廣東省科學院動物研究所,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣州 510260)

昆蟲是地球上物種最豐富的動物類群之一,與人類關系十分密切。在長期的進化過程中,昆蟲與外界環境相互作用,形成了復雜且靈敏的化學感受系統(如嗅覺和味覺系統)。在參與昆蟲嗅覺行為的多種蛋白中,有一類小分子量的親水性轉運蛋白—氣味結合蛋白(Odorant binding proteins, OBPs)。這類蛋白存在于昆蟲嗅覺感受器的淋巴液中,能夠將外界疏水性的氣味分子運輸到嗅覺神經元樹突狀膜上,然后激活神經元樹突狀膜上的氣味受體ORs(odorant receptors, ORs)實現信號轉導,最終通過中樞神經系統產生行為反應(Lealetal., 2013; Pelosietal., 2018)。因此,從嗅覺發生的過程可以看出,OBPs在識別氣味分子和引發昆蟲生理反應的過程中起到了極其重要的作用(趙慧婷等,2020)。

自昆蟲第一個OBP蛋白被Vogt等(1981)從多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中鑒定得到以來,已在鱗翅目(Sunetal., 2017a)、鞘翅目(Lietal., 2017)、雙翅目(Zhaoetal., 2018)、膜翅目(Zhaoetal., 2016)、直翅目(Jiangetal., 2018)和半翅目(Sunetal., 2017b)等多類昆蟲中鑒定獲得了OBPs。Forêt和Maleszka(2006)在意大利蜜蜂Apismellifera基因組中共鑒定到21個OBPs,其中的9個基因在觸角中特異性表達,其余基因在各個組織或特異的組織中表達。隨后趙慧婷(2021)對21個OBPs在意大利蜂頭部表達模式進行研究表明,13個OBPs在頭部高表達,且大多數OBPs在4日齡表達量最高。目前在中華蜜蜂Apisceranacerana基因組中共鑒定到17個OBPs(Zhaoetal., 2016)。其中Weng(2015)發現AcerOBP1容易與蜂王信息素結合。Li(2020)發現AcerOBP2更容易與一般氣味結合。除此之外,AcerOBP11還能與蜜蜂信息素和一些植物揮發物結合(Songetal., 2018)。最近研究表明,AcerOBP10參與氧化應激防御(Guoetal., 2021)。

中華蜜蜂Apisceranacerana作為中國特有的蜜蜂品種,具有嗅覺靈敏、采集力強、善于利用零星蜜源植物、抗逆抗病能力強等突出的優點,適合在中國的山林地區飼養(杜亞麗等,2016)。對中華蜜蜂OBPs的研究,不僅可以明確中華蜜蜂的嗅覺識別機制,還能夠為科學飼養管理提供理論指導。目前對中華蜜蜂OBP4的研究報道較少,因此本研究通過分析AcerOBP4基因在中華蜜蜂不同發育階段和不同組織中的表達模式及分子特性,為研究蜜蜂OBP4蛋白更廣泛的生理功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 中華蜜蜂采集

供試蜜蜂均采自廣東省科學院動物研究所廣州綜合試驗站蜂場。從幼蟲脾上采集正在哺育小幼蟲的蜜蜂作為哺育蜂,只有將頭伸進幼蟲巢房至少10 s的蜜蜂才被認為是哺育蜂。在蜂巢門口采集后足攜帶花粉的蜜蜂作為采集蜂。最后從成熟的封蓋子脾中采集剛出房的1日齡成年工蜂。蜜蜂的采樣均來自3個蜂群,每個蜂群采集15頭蜂。

解剖1日齡工蜂、哺育蜂和采集蜂,不同組織部位包括頭、胸、腹、足、觸角、腦。保存在-80℃。

1.2 RNA提取和cDNA合成

按照Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)說明書提取各樣品的總RNA。經核酸測定儀檢測RNA的濃度后,使用反轉錄試劑盒(AG,中國大連)進行cDNA合成。合成過程:①基因組DNA的去除。反應總體系為10 μL: 5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,總RNA 500 ng,RNase Free ddH2O補足10 μL。反應程序:42℃孵育2 min;②反轉錄。反應總體系為20 μL: 5×Evo M-MLV RT Reaction Mix 4.0 μL,RNase Free ddH2O 6 μL步驟①的反應液10 μL。反應程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃,2 min。

1.3 引物設計

在NCBI數據庫中搜索中華蜜蜂OBP4(序列號:AKQ98505)基因的核苷酸序列,采用Primer 5.0軟件設計引物,用qRT-PCR實驗。

1.4 AcerOBP4的生物信息學分析

在NCBI中用Blastn(http://blast. ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)工具進行氨基酸序列的同源性分析;ProtParam(http://web.expasy.org/cgi bin/protparam/protparam)預測蛋白的分子量、等電點等理化性質;ProtScale(http://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl)進行疏水性分析;PSORT II(http://psort. hgc.jp/form2.html)和LocTree 3(https://rostlab.org/ services/loctree3/)進行亞細胞定位;將去除信號肽的氨基酸序列導入在線軟件Swiss-Model(http://swissmodel. expasy.org/)三級結構的預測。利用DNAMAN軟件進行氨基酸的多序列比對,采用MEGA 5.2軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹,Bootrap為1 000次。

1.5 熒光定量PCR反應

以各樣品的cDNA(反轉錄之后進行4倍稀釋)為模板,使用SYBR? Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行熒光定量PCR。反應體系(20 μL): SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL上下游引物(Acerobp4F: 5′TCGAAGCCTGCGTATT CCAA3′; Acerobp4R: 5′ GCAGCTTCGCTAATACA CTGC 3′)各0.8 μL,cDNA模板3 μL,DEPC水5.4 μL。反應條件:95℃預變性30 s;接著進行40個循環:95℃ 30 s,60℃ 30 s。測定熔解曲線的反應條件:以0.5℃的升溫速度從60℃升至95℃。以β-actin為內參,每個樣品進行2個技術重復。

1.6 數據處理

對于qPCR檢測數據,根據擴增曲線獲得的Ct值,采用2-ΔCT法進行數據分析。利用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析,Duncan法進行多重比較,并利用GraphPad Prism 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 AcerOBP4的分子特性

AcerOBP4蛋白分子式為C697H1099N177O219S11,預測分子量為15.81 kDa,理論等電點為4.57。在組成AcerOBP4蛋白的18種氨基酸中,谷氨酸(Glu)所占的比例最高,達到10.9%;帶正電荷氨基酸總數(Arg+Lys)為15,帶負電荷氨基酸總數(Asp+Glu)為16,表明該蛋白帶負電荷;總平均疏水系數(GRAVY)為-0.167,不穩定系數為38.29,脂溶系數為91.88,說明該蛋白比較穩定。AcerOBP4的氨基酸序列中含有5個保守的半胱氨酸位點,屬于Minus-c OBP亞家族。

2.2 AcerOBP4的結構預測

NCBI在線結構域分析結果表明,AcerOBP4編碼產物的第51-116位氨基酸之間存在一個昆蟲氣味結合蛋白家族的保守結構區域PBP-GOBP superfamily(圖1)。疏水性分析顯示,AcerOBP4的氨基酸序列中,第48位氨基酸Score值最低為-2.733,第7、8位氨基酸最高為3.289;存在多個比較明顯的疏水區域(Score為正值的區域),它們可能是脂溶性氣味分子的結合位點。亞細胞定位結果表明,AcerOBP4蛋白可能存在于內質網(55.6%)、細胞核(11.1%)、高爾基體(11.1%),線粒體(11.1%)和細胞質(11.1%)中,主要集中在分泌途徑上,說明該蛋白屬于分泌型蛋白。以東方蜜蜂OBP4為模板對其三維結構進行預測(圖2),結構相似性為24.5%,無跨膜螺旋(number of predicted TMHs=0)。

圖1 AcerOBP4的保守結構區域預測Fig.1 Prediction of AcerOBP4’s conservative structure

2.3 AcerOBP4的氨基酸序列比對和系統進化分析

在NCBI核酸數據庫將AcerOBP4進行BlastX分析,找到與目的基因有同源性的其他昆蟲的氨基酸序列。序列比對結果顯示。中華蜜蜂AcerOBP4與意大利蜜蜂AmelOBP4的氨基酸序列一致性最高(圖3),達到78%。使用MEGA 5.2軟件鄰位相連法進行1 000次重復計算后構建系統進化樹。所有選用的昆蟲OBPs形成兩個大的分支(圖4):中華蜜蜂AcerOBP4、西方蜜蜂AmelOBP4、松樹蜂SirexnoctilioFabricius OBP12、三葉蜂TrissolcusjaponicusOBP3、胡蜂DiachasmaalloeumOBP69a、桑蝗聚瘤姬蜂GregopimplakuwanaeOBP7、布氏游蟻EcitonburchelliOBP7聚為一個分支,其中AcerOBP4與AmelOBP4親緣關系最近;角壁蜂OsmiacornutaOBP1和草履蚧Drosichacorpulenta(Kuwana) OBP15聚為另一分支。

圖2 AcerOBP4的蛋白質三維結構預測模型Fig.2 Three-dimensional prediction structure of AcerOBP4 established by Swiss-Model

圖3 中華蜜蜂AcerOBP4與其他昆蟲氣味結合蛋白氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignments of AcerOBP4 with the known OBPs from other insects注:保守半胱氨酸位點用黃色方框標注Conversed cysteine residues were boxed in yellow. OBP蛋白來源及GenBank登錄號Origin of OBP proteins and their GenBank accession numbers: AmelOBP4, 意大利蜂Apis mellifera(NP_001011589.1); AcerOBP4, 中華蜜蜂Apis cerana cerana(AAR83081); OcorOBP1, 角蜜蜂Osmia cornuta(AGI05200); DcorOBP15, 草履馱Drosicha corpulenta(ALV87608); EburOBP7,布氏游蟻 Eciton burchellii(KAH0950003); SnocOBP12, 松樹蜂Sirex noctilio(QHN69053); TjapOBP3, 三葉蜂Trissolcus japonicus(QNC49768); GkuwOBP7, 柔蝗聚瘤姬蜂Gregopimpla kuwanae(UEN71172); DalOBP69a, 胡蜂Diachasma alloeum(XP_015125081)。

圖4 基于氨基酸序列構建的OBPs系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of OBPs based on amino acid sequence

2.4 AcerOBP4 mRNA時空表達分析

通過實時熒光定量PCR技術分析AcerOBP4mRNA在1日齡工蜂、采集蜂、哺育蜂不同組織中mRNA的表達差異,研究結果發現,AcerOBP4在中華蜜蜂不同發育期的觸角、頭、胸、腹、足中均有表達,但其表達程度有差異(圖5～圖7)。1日齡工蜂觸角和足的表達量,均極顯著高于其他組織(P<0.01),而頭、胸、腹、腦的表達量沒有差異(P>0.05)。哺育蜂觸角中的表達量極顯著高于其他組織(P<0.01),而足中表達量極顯著高于頭、胸、腹、腦部(P<0.01)。采集蜂觸角中的表達量極顯著高于其他組織(P<0.01),足中的表達量也顯著高于觸角之外的其他組織(P<0.01),胸部表達量最低。

圖5 AcerOBP4在1日齡中華蜜蜂不同組織中的表達量Fig.5 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues from one-day bees of Apis cerana cerana

圖6 AcerOBP4在中華蜜蜂哺育蜂不同組織中的表達量Fig.6 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues of nurse Apis cerana cerana

圖7 AcerOBP4在中華蜜蜂采集蜂不同組織中的表達量Fig.7 Expression profiles of AcerOBP4 in different tissues of forager Apis cerana cerana

3 結論與討論

本研究通過生物信息學分析了中華蜜蜂AcerOBP4基因序列,該基因編碼138個氨基酸,分子量為15.81 kDa,序列中含有保守的半胱氨酸位點,AcerOBP4只有5個保守的Cys位點,屬于Minus-C OBP亞家族。氨基酸同源序列和系統進化樹分析表明,AcerOBP4與意大利蜜蜂AmelOBP14同源性較高,推測它們是直系同源基因。通過對AcerOBP4mRNA的時空表達分析,本研究發現在1日齡工蜂、哺育蜂、采集蜂3個發育階段,觸角中OBP4的表達量在任一發育階段都顯著高于其他組織,此外,足中的OBP4是除了觸角之外表達量最高的。

有研究已證實,在昆蟲觸角中高表達的OBPs主要行使嗅覺功能(Lealetal.,2013; Qiuetal.,2018),如多音天蠶蛾AntheraeapolyphemusApolPBPs(Vogt and Riddiford,1981)。斜紋夜蛾SpodopteralituraSlitGOBP(吳仲南等,2009)、中華按蚊AnophelessinensisAsinOBP1(秦贈等,2015)、桃蛀螟ConogethespunctiferalisCpunPBP1(賈小儉等,2015)也是在觸角中特異性高表達。本研究發現AcerOBP4在中華蜜蜂各組織中均有表達,但在觸角中表達量相對較高,作為社會性昆蟲,蜜蜂必須依賴其復雜的嗅覺系統來調節蜂巢內外的一切活動,如哺育幼蟲和蜂王、識別同伴和尋找蜜粉源植物等。觸角是蜜蜂最主要的嗅覺感受器官,其上分布著大量感器,而OBP4在不同日齡工蜂觸角的表達量是有變化的,暗示該基因在蜜蜂的嗅覺調控過程中發揮一定的作用。Forêt(2006)分析了西方蜜蜂OBPs在幼蟲、蛹、1日齡幼蜂和采集蜂的表達量,結果顯示采集蜂,工蜂和蜂王的觸角中AmelOBP4都存在高表達,并且在新出房蜜蜂的足中也有表達,與本研究發現相同,推測中華蜜蜂的足也參與了蜜蜂的嗅覺行為。

本研究結果表明AcerOBP4主要在觸角中表達,并且在足中也有表達,推測AcerOBP4主要參與中華蜜蜂的嗅覺行為,為了進一步研究AcerOBP4的作用,需要繼續對其生物學功能進行深入研究。最后AcerOBP4在足中的表達量僅次于在觸角中的表達量,表明足可能也參與了中華蜜蜂的嗅覺行為,這需要進一步研究。