黑水虻抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞免疫調控作用研究

許曉燕,孫虹霞,崔會程,胡紫媛,夏 嬙

(遵義醫科大學珠海校區,廣東珠海 519041)

昆蟲抗菌肽是研究最早的一類抗菌肽,目前在抗菌肽數據庫中已記錄的昆蟲抗菌肽種類已達310種,均具有廣泛的功能。昆蟲抗菌肽不僅具有抑菌、抑癌活性,還具有免疫調節活性。如從埃及伊蚊Aedesaegypti體內提取的抗菌肽AeaeCec 1-5(Linetal., 2018)、從雙叉犀金龜Allomyrinadichotoma體內提取到的抗菌肽Allomyrinasin(Leeetal., 2019)、從螞蟻毒液中提取的陽離子抗菌肽P17(Khaddoujetal., 2017),均具有良好的免疫調節作用。

黑水虻HermetiaillucensL.是世界性分布的重要資源昆蟲,近年來隨著黑水虻幼蟲在處理畜禽糞便及廚余垃圾等方面的廣泛應用(Zhangetal., 2021),其抗菌肽研究也越來越受重視。黑水虻抗菌肽不僅具有良好的抗菌(Danielaetal., 2019; Leeetal., 2020)、抗癌(Huetal., 2018)活性,其免疫調節活性也不容忽視。研究表明,黑水虻抗菌肽DLP2和DLP4不僅可以有效提高被多重耐藥性金黃色葡萄球菌感染小鼠血清中IL-10、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的表達,還能夠抑制TNF-α、IL-6及巨噬細胞趨化蛋白(MCP)-1的表達(Lietal., 2017)。但是,關于黑水虻抗菌肽免疫方面的研究僅限于此,尚無全面的免疫調控作用研究。

巨噬細胞在免疫系統中占據重要地位,它們不僅可以啟動免疫反應,還可作為效應細胞參與感染和炎癥反應,在免疫調節中發揮著重要的作用,是免疫調節的重要靶細胞。小鼠巨噬細胞(RAW264.7)具有極強的黏附和吞噬抗原能力,是免疫學中常用的細胞株,近年來廣泛用于氧化應激、免疫活性、炎癥反應及其機制研究。

課題組前期自提的黑水虻抗菌肽HI-3不僅對自然界中存在較廣的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及產氣桿菌有較強的抑制作用,還可以有效抑制人鼻咽癌細胞(CNE2)和人結腸癌細胞(HCT-8)的體外增殖,且對正常細胞無顯著影響(田忠, 2017; 高嘉敏, 2021)。本試驗在課題組前期研究基礎上,以RAW264.7細胞為模式細胞,研究黑水虻抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞形態、增殖、吞噬、分泌NO和細胞因子以及氧化應激活性影響,以闡明抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞免疫調控作用,為拓展黑水虻抗菌肽在免疫領域的應用研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1黑水虻抗菌肽HI-3

選取黑水虻5齡幼蟲,采用大腸桿菌菌液針刺誘導法誘導其產生抗菌肽,培養24 h后斷頭取其血淋巴,利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化得抗菌肽HI-3,其純度大于95%,分子量為5.98 kDa。

1.1.2細胞株

RAW264.7細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3主要試劑

DMEM培養液、青霉素-鏈霉素混合溶液、胎牛血清均購自美國GIBCO公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司;脂多糖(LPS)購自上海源葉生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、高效RIPA組織/細胞裂解液、中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;小鼠IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α檢測試盒均購自武漢華美生物工程有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

1.1.4主要儀器

3K15冷凍高速離心機,購自德國SIGMA公司;HF90/HF240 CO2培養箱,購自上海力康生物醫療科技控股有限公司;BDS 300PH倒置相差顯微鏡,購自重慶奧特光學儀器有限公司;Multiskan Go全波段酶標儀,購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養

將RWA264.7細胞接種在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM完全培養液中,放入二氧化碳培養箱(37℃,5% CO2),培養24 h。

1.2.2構建細胞炎癥模型的LPS濃度篩選

取對數生長期細胞,調整細胞密度為1×104個/mL,以每孔100 μL接種于96孔板,隨機設計為陰性對照組和LPS組,培養24 h后棄掉上清,陰性對照組中每孔重新加入同體積的培養液,模型組中每孔加入同體積的不同濃度LPS溶液(終濃度為0.1、1、10、100 ng/mL),每組5個重復,24 h后光學顯微鏡下觀察細胞形態,并收集細胞上清檢測其NO濃度。根據實驗結果選擇適宜的LPS濃度,進行后續實驗。

1.2.3抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞形態的影響

按照1.2.1方法培養細胞,200 g/min離心3 min,棄上清,調整細胞密度為1×106個/mL,以每孔2 mL接種于6孔板隨機設置陰性對照組、陽性對照組和實驗組,每組5個重復。培養24 h后棄掉原培養液,陰性對照組加入1 mL新鮮培養液,陽性組加入1 mL含有LPS(1 ng/mL)的培養液,實驗組分別加入1 mL含不同濃度抗菌肽HI-3(濃度依次為20、40、80、160、320 μg/mL)的培養液,放回培養箱繼續培養24 h,光學顯微鏡下觀察細胞形態變化并記錄。

1.2.4抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞增殖的影響

按照1.2.3方法進行細胞培養及實驗分組,每組5個重復。加藥后于96孔板培養RAW264.7細胞24 h后,棄去96孔板中培養液,加入110 μL含有CCK-8的無血清培養液,CCK-8與培養液的體積比為1∶10,繼續培養1 h。于450 nm波長處檢測各孔吸光度值(A值),依據公式計算細胞的增殖指數。

增殖指數=實驗孔A值/空白孔A值

1.2.5抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞吞噬功能的影響

按照1.2.4的方法完成鋪板加藥,每組5個重復,培養24 h后棄去原培養液,并用PBS清洗2次。各孔依次加入220 μL中性紅染液與DMEM培養液的混合液(體積比為1∶10),放回培養箱中孵育4 h。棄去含有中性紅染液的培養液,并用PBS清洗2次,隨后加入200 μL中性紅檢測裂解液,放于搖床上裂解10 min。調整波長至540 nm,檢測各個實驗孔的A值,并依據公式計算吞噬指數。

吞噬指數=實驗孔A值/空白孔A值

1.2.6抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞生成NO的影響

按照1.2.3方法進行鋪板加藥,培養24 h后取50 μL細胞上清于96孔板中,每組設置5個重復,按照試劑盒說明書依次加入Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ,于540 nm波長處測定樣本吸光度值,并根據標準曲線計算NO濃度。

1.2.7抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

按照1.2.3步驟進行鋪板加藥,每組5個重復,培養24 h后取上清至2 mL的無菌EP管中,4℃、1 000 g/min,離心15 min,按照試劑盒說明書檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量變化,帶入標準曲線計算相應的細胞因子濃度。

1.2.8抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞抗氧化物活性的影響

按照1.2.3步驟進行鋪板加藥,每組5個重復,培養24 h后棄掉細胞上清液,并用PBS清洗3次,加入200 μL的RIPA裂解液,放于冰上裂解30 min,并將其收集于2 mL無菌EP管中,18 892 g/min,4℃冷凍離心10 min。將離心后的上清液放于冰上待用,并按照試劑盒說明書檢測樣品中SOD活力、MDA及T-AOC含量,具體公式如下:

(1)SOD活力(U/mL)=SOD抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數×樣本測試前稀釋倍數

(2)MDA含量(μmmol/mg)=樣本MDA濃度/樣本蛋白濃度

(3)T-AOC含量(mmol/g)=樣本的Trolox摩爾濃度/蛋白濃度

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0分析軟件進行數據統計與分析。兩兩比較采用t檢驗,兩組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 LPS濃度篩選

隨著LPS濃度升高,NO濃度逐漸增高,當濃度達到1 ng/mL時,與陰性對照相比具有顯著性差異,當LPS濃度達到10 ng/mL及以上時,細胞出現破碎甚至死亡,因而后續實驗選用1 ng/mL LPS建立炎癥模型(圖1)。

2.2 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞形態的影響

20、40、80、160和320 μg/mL處理濃度抗菌肽HI-3作用于RAW264.7細胞24 h后,細胞形態與陰性對照組細胞形態(圖2-A)相比差異不明顯。表現為細胞圓潤有光澤,細胞呈島狀分布,但略有偽足伸出(圖2-B, F);但與LPS陽性對照組細胞形態相比差異明顯,LPS陽性對照組細胞多數有偽足伸出,呈現棘形或者梭形等不規則形狀,胞漿顆粒明顯,細胞顯著增大(圖2-G),這是細胞被過度激活后的表現。結果說明,各處理濃度的抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞形態均無顯著影響。

圖1 不同濃度LPS對RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LPS on NO production in RAW264.7 cells

圖2 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞形態的影響(400×)Fig.2 Effect of antimicrobial peptide HI-3 from black water fly larvae on the morphology of RAW264.7 cells (400×)注:A,陰性對照組;B,HI-3(20 μg/mL);C,HI-3(40 μg/mL);D,HI-3(80 μg/mL);E,HI-3(160 μg/mL);F,HI-3(320 μg/mL);G,LPS組(1 ng/mL)。Note: Negative control group; B, HI-3 (20 μg/mL); C, HI-3 (40 μg/mL); D, HI-3 (80 μg/mL); E, HI-3 (160 μg/mL); F, HI-3 (320 μg/mL); G, LPS group (1 ng/mL).

2.3 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞增殖的影響

在20～320 μg/mL處理濃度范圍內,抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞均無顯著影響,細胞增殖指數均在0.94以上,與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05),與LPS陽性對照組相比增殖指數顯著降低(P<0.01)(圖3),說明抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞無毒性,且對其增殖活力無顯著影響。

圖3 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.3 Effect of antibacterial peptide HI-3 on the proliferation of RAW264.7 cells注:與陰性對照組相比:*P<0.05,**P<0.01;與LPS組(1 ng/mL)相比:# P<0.05,## P<0.01。下圖同。Note: Compared with negative control group: *P<0.05, ** P<0.01; Compared with lipopolysaccharide group (1 ng/mL): # P<0.05, ##P<0.01.Same below.

2.4 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞吞噬功能的影響

20、40、80、160和320 μg/mL濃度下抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞吞噬功能的影響研究結果表明,與陰性對照組相比,各處理濃度下HI-3均能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力(P<0.01),且具有一定的濃度依賴性。當HI-3濃度達到320 μg/mL時,其對RAW264.7細胞的吞噬能力影響最強,但仍顯著低于LPS陽性對照組(P<0.01),表明抗菌肽HI-3可以提升巨噬細胞的吞噬能力,但不會過度吞噬,具有一定的開發前景(圖4)。

圖4 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞吞噬功能的影響Fig.4 Effect of antibacterial peptide HI-3 on phagocytosis of RAW264.7 cells

2.5 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞生成NO的影響

不同濃度抗菌肽HI-3作用于RAW264.7細胞后細胞內NO的生成量隨著HI-3濃度的增加而增加,但是160 μg/mL以下處理濃度組NO生成量與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05),僅在處理濃度達到160 μg/mL及以上時,才與陰性對照組相比顯著增加(P<0.01),但仍極顯著低于LPS陽性對照組的NO生成量(P<0.01)(圖5)。

圖5 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.5 Effect of antimicrobial peptide HI-3 on NO of RAW264.7 cells

2.6 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

巨噬細胞通過分泌IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10等細胞因子,調節免疫細胞生長、分化和遷移。本研究采用ELISA試劑盒分別檢測了20、40、80、160和320 μg/mL處理濃度下抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響。結果表明,隨著HI-3濃度的增加RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-α和IL-1β含量遞增,當濃度達到40 μg/mL及以上時與陰性對照組細胞分泌細胞因子相比顯著性增加(P<0.05),但顯著低于LPS陽性對照組細胞的分泌量(P<0.05);而抑炎因子IL-10的分泌量呈遞減趨勢,20～80 μg/mL處理濃度的細胞分泌IL-10的含量與LPS陽性對照組相比顯著增加,但仍顯著低于陰性對照組細胞IL-10的分泌量(P<0.05)(圖6)。

圖6 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響Fig.6 Effect of antimicrobial peptide HI-3 on cell factor of RAW264.7 cells注:A,IL-6;B,TNF-α;C,IL-1β;D,IL-10。Note: A, IL-6; B, TNF-α; C, IL-1β; D, IL-10.

2.7 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞抗氧化活性的影響

在40～320 μg/mL處理濃度范圍內,隨著抗菌肽HI-3濃度的增加,RAW264.7細胞內SOD活力和T-AOC活性均隨之升高,并顯著高于陰性對照組和LPS陽性對照組含量(P<0.01),如圖7、圖8所示;MDA含量與陰性對照組相比,僅在HI-3濃度達到320 μg/mL時,才顯著高于陰性對照組的MDA含量(P<0.05),其余濃度產生的MDA含量與陰性對照組相比均無顯著差異(P>0.05);但與LPS陽性組相比,各個處理濃度下產生的MDA均極其顯著降低(P<0.01),見圖9。說明HI-3能夠顯著提高RAW264.7細胞內SOD活力和T-AOC活性,且不產生脂質過氧化物,具有較好的抗氧化活性。

圖7 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞SOD的影響Fig.7 Effect of antimicrobial peptide HI-3 on SOD of RAW264.7 cells

圖8 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞MDA的影響Fig.8 Effect of antimicrobial peptide HI-3 on MDA of RAW264.7 cells

圖9 抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞T-AOC的影響Fig.9 Effect of antimicrobial peptide HI-3 on T-AOC of RAW264.7 cells

3 結論與討論

巨噬細胞廣泛分布于各種組織中,是生物體內最常見的免疫細胞,也是生物抵御病原體入侵的門戶(Qiuetal., 2019; Yangetal., 2021)。本研究表明,黑水虻抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞的正常生長和增殖均無顯著影響,說明實驗濃度范圍內的抗菌肽HI-3對RAW264.7細胞無毒害作用。

吞噬作用是評價巨噬細胞活化能力的一個關鍵指標,在非特異性免疫防護中具有重要的作用。黑水虻抗菌肽HI-3能夠有效增強RAW264.7細胞的吞噬能力,且吞噬能力隨著抗菌肽濃度的增加而增強,但顯著低于LPS陽性對照組細胞的吞噬能力。說明本研究各處理濃度HI-3均可顯著刺激RAW264.7細胞,提高其吞噬功能,但不會過度吞噬,起到了一定的免疫調節作用。此結果與刁靜靜等研究綠豆肽濃度依賴性提高巨噬細胞的吞噬能力結果相一致(刁靜靜等, 2019)。

NO是生物體內一種重要的信號傳導介質和效應分子,可參與多種生理活動,并與免疫系統關系密切(El-Haj and Bestle, 2017; Kotsiouetal., 2021)。各處理濃度抗菌肽HI-3均會刺激RAW264.7細胞少量分泌NO,且在高濃度時顯著高于陰性對照組,但均極顯著低于LPS陽性對照組,從而表明HI-3的處理在一定程度上提高了RAW264.7細胞的免疫調節能力,此結果與趙杰(2020)、葉蕾(2019)等人的研究結果相一致。在巨噬細胞中,NO的合成主要依賴于iNOS(Tenopoulouetal., 2020)。然而,本研究尚未涉及iNOS在NO分泌中的作用,還有待于后續進一步研究。

細胞因子在免疫應答中起著至關重要的作用。TNF-α參與免疫調節等多種生理病理反應,在誘導后會促進IL-6和IL-1β的分泌,增強免疫反應。IL-6具有促進T、B細胞增殖和分化的功能(Klimpel, 1980; Yasukawaetal., 1987),且其既是促炎因子也是抗炎因子。IL-1β不僅可以激活先天免疫細胞如B細胞,促使其分化為漿細胞參與體液免疫,同時也可促進巨噬細胞的抗原遞呈能力,吸引中性粒細胞而引發炎癥,進而增強免疫細胞的殺傷力(Bentetal., 2018)。本研究結果表明,HI-3作用于RAW264.7后,當濃度達到40 μg/mL及以上時3種細胞因子的分泌量均高于陰性對照組,表明40 μg/mL及以上濃度的HI-3可以有效地激活RAW26.7細胞免疫反應,引起上述細胞因子的分泌。并且,這種激活具有一定的濃度依賴性,在320 μg/mL時,激活能力最強,其細胞因子的分泌量達到最大,但又極顯著低于LPS陽性對照組,表明HI-3可以發揮免疫激活能力,誘導炎性因子適當分泌,但又不引發炎癥反應,從而避免了免疫系統被過度激活。這與王亞飛等發現鷹嘴豆肽可以激活RAW264.7細胞的免疫活性,促進IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌進而發揮免疫增強功能相類似(王亞非等, 2021)。Yao等人亦發現鰻鱺肽可以以濃度依賴性的方式促進RAW264.7細胞分泌IL-6和TNF-α(Yaoetal., 2020)。IL-10是一種抑炎因子,可抑制炎癥的過度反應,上調先天免疫,促進組織修復,維持組織穩態(Ouyangetal., 2019),但IL-10過度表達則會導致免疫抑制(Pealozaetal., 2016)。本研究中黑水虻抗菌肽HI-3可下調RAW264.7細胞分泌IL-10的能力,此結果與楊勝杰等研究核桃肽能夠降低人單核細胞中IL-10的分泌量一致(楊勝杰等, 2019)。因此,抗菌肽HI-3可以通過調控細胞因子的分泌,進而影響巨噬細胞的免疫功能。

巨噬細胞在發揮免疫作用的過程中也會產生各種氧化物質如MDA和自由基,這些物質的出現會導致機體產生炎癥損傷,誘發多種疾病。而抗氧化物質能夠有效中和自由基,降低氧化物,維持機體穩態,從而間接起到免疫調節作用。其中,常見的抗氧化物質有SOD和T-AOC。SOD能夠有效清除機體產生的過量自由基(Yaribeygietal., 2018),T-AOC是機體內衡量抗氧化物質多少的重要指標(Mazdaketal., 2020)。Wang等發現槲皮素能夠有效提高斑馬魚Brachydaniorerio的SOD和T-AOC的活性,進而提高斑馬魚的免疫活性和抗氧化能力(Wangetal., 2020)。本研究發現抗菌肽HI-3亦能夠顯著提高RAW264.7細胞內SOD活力和T-AOC的含量,且具有一定的濃度依賴性,表明HI-3對細胞的抗氧化作用也在其免疫調節過程中發揮了作用。此外,HI-3對細胞內MDA含量影響的結果也顯示HI-3不會在細胞內產生過多的脂質過氧化物,進一步避免了對細胞的氧化損傷。

上述研究表明,抗菌肽HI-3可以通過增強巨噬細胞吞噬功能、適量增加細胞內NO的合成、調節細胞因子分泌及增強細胞的抗氧化作用,從而達到對RAW264.7細胞的免疫調控作用;同時,HI-3又不會過度刺激巨噬細胞增殖,不引起炎癥反應,具有良好的開發前景。