卵黃原蛋白在昆蟲生理猖獗機(jī)制中的作用及應(yīng)用前景

魯玉杰,魯 婷,苗世遠(yuǎn),王爭(zhēng)艷,楊斌斌

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧食和物資儲(chǔ)備學(xué)院,鄭州 450001;2. 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212100)

昆蟲個(gè)體較小、易躲藏、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、食性廣泛且具有耐饑能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快等驚人的優(yōu)勢(shì),使其成為世界上種類繁多、數(shù)量龐大、分布廣泛的動(dòng)物種類。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,許多昆蟲種群因氣候變化、人工殺蟲劑濫用等因素的影響,逐漸從原先的次要害蟲變?yōu)橹匾οx,容易在適生的環(huán)境條件下發(fā)生猖獗并且可能爆發(fā)成災(zāi)。近年,草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda入侵我國(guó)云南隨后迅速擴(kuò)散至全國(guó),因適應(yīng)區(qū)域廣、遷移性強(qiáng)、繁殖力高、抗藥性強(qiáng)和暴食為害的特點(diǎn)對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失(吳秋琳,2019)。有研究表明,在田間種群發(fā)生較重情況下,草地貪夜蛾在美洲和非洲造成玉米減產(chǎn)20%～72%,嚴(yán)重威脅玉米種植戶經(jīng)濟(jì)收入和全球糧食安全(萬敏等,2022)。作為糧庫中常見的害蟲,儲(chǔ)糧書虱,如嗜蟲書虱Liposcelisentomophila已經(jīng)從20年前的次要害蟲成為危及世界糧食和食品安全的重要儲(chǔ)糧害蟲之一。昆蟲猖獗不僅會(huì)造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)、威脅儲(chǔ)糧安全、增大經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致各種皮膚病、呼吸系統(tǒng)疾病等爆發(fā)(Ahmedanietal.,2010)、病毒的傳播,如褐飛虱Nilaparvatalugens猖獗傳播的水稻黑條矮縮病毒病嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)等問題(Sunetal.,2017)。因此,研究昆蟲猖獗機(jī)制,控制昆蟲猖獗問題的發(fā)生成為植物保護(hù)工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

一般認(rèn)為引起昆蟲猖獗現(xiàn)象的機(jī)制主要是由生態(tài)及生理調(diào)控因素協(xié)同引發(fā)的一個(gè)動(dòng)態(tài)響應(yīng)過程,即昆蟲逐漸適應(yīng)生態(tài),引發(fā)基因階段式分化和突變的現(xiàn)象。氣候變暖、CO2濃度升高及臭氧層破壞等生態(tài)因素加劇了害蟲的發(fā)生世代。多數(shù)昆蟲在繁殖的適溫范圍內(nèi)繁殖力隨溫度的升高而增強(qiáng),如甘藍(lán)蚜Brevicorynebrassicae在適生溫度范圍內(nèi),溫度越高繁殖能力越強(qiáng),產(chǎn)卵量也更高(Sohetal.,2018)。CO2的升高對(duì)褐飛虱的增殖具有顯著的促進(jìn)作用,褐飛虱種群數(shù)量增加(Guru Pirasanna Pandietal.,2018)。紫外線照射棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)1～4 h后,其卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)的表達(dá)量和產(chǎn)卵量會(huì)顯著增加(王智健等,2014)。昆蟲的強(qiáng)適應(yīng)性在長(zhǎng)期進(jìn)化中引發(fā)基因突變現(xiàn)象,如植食性昆蟲為了不斷適應(yīng)植物的防御反應(yīng),逐漸在形態(tài)上發(fā)生變異,包括多型翅,分化出口器,如咀嚼式、刺吸式以及虹吸式口器等(Hermsmeieretal.,2001)。多數(shù)昆蟲食性的轉(zhuǎn)變及擴(kuò)大更是加劇了其猖獗,如大多數(shù)白蟻的食物原為枯木或草,但Donovan等(2001)發(fā)現(xiàn)其食物已經(jīng)擴(kuò)大到包括栽培真菌、碎屑和土壤有機(jī)質(zhì)。更有昆蟲已經(jīng)進(jìn)化出了利用專性共生細(xì)菌念珠菌CandidatusNasuiadeltocephalinicola攜帶額外Vgs的策略,以保證昆蟲的最佳繁殖(Maoetal.,2020)。

昆蟲適應(yīng)能力的最典型特征之一是繁殖能力的增強(qiáng),雌性昆蟲不斷進(jìn)化,優(yōu)化卵巢管結(jié)構(gòu)和卵子發(fā)生過程等都使昆蟲能夠適應(yīng)各種逆境而繁衍生息。在昆蟲種群繁衍和擴(kuò)增過程中,生殖系統(tǒng)對(duì)于維持其種群數(shù)量及后代延續(xù)至關(guān)重要,尤其是昆蟲Vg基因已成為了昆蟲繁殖的關(guān)鍵因子之一。Vg是由6～7 kb Vg mRNA合成的200 kDa左右的含有共價(jià)結(jié)合的碳水化合物、磷酸鹽和非共價(jià)結(jié)合脂質(zhì)的高分子量磷酸糖蛋白(Tufail and Takeda,2008);廣泛存在于卵生雌性動(dòng)物的血淋巴、脂肪體和卵巢中,是幾乎所有卵生動(dòng)物卵黃蛋白的前體(Yolk protein precursors,YPPs)(Sappingtonetal.,1998)。在大多數(shù)昆蟲中,Vg在雌性昆蟲脂肪體中經(jīng)糖基化、脂化、磷酸化、蛋白水解裂解等過程合成后,釋放到血淋巴,經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后成為由幾個(gè)亞基組成的天然卵黃原蛋白,后被發(fā)育中的卵母細(xì)胞外表面的卵黃蛋白原受體(vitellogenin receptor,VgR)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用選擇性吸收(Tufail and Takeda,2009;戈林泉和吳進(jìn)才,2010)。Vg在昆蟲卵黃發(fā)生(Vitellogenesis)過程及昆蟲生殖過程起重要作用(Wuetal.,2018)。

目前,對(duì)于昆蟲Vg的理化性質(zhì)及分子調(diào)節(jié)通路等研究已有很多,但缺乏昆蟲Vg與昆蟲猖獗關(guān)系之間的系統(tǒng)總結(jié)與Vg的實(shí)踐應(yīng)用分析。因而,本文從Vg入手,闡述Vg對(duì)昆蟲猖獗的影響與機(jī)制,探討昆蟲Vg作為害蟲防治靶點(diǎn)的實(shí)際性操作技術(shù)的利弊,為研發(fā)害蟲防治技術(shù)提供新靶標(biāo)和新思路。

1 卵黃原蛋白在昆蟲生理猖獗中的作用

害蟲防治過度依賴或?yàn)E用化學(xué)農(nóng)藥易誘導(dǎo)害蟲再猖獗現(xiàn)象的產(chǎn)生,再猖獗機(jī)制一般可分為生態(tài)再猖獗和生理再猖獗,其中,生理再猖獗主要是藥劑引起害蟲的毒物興奮效應(yīng)及補(bǔ)償作用(刺激產(chǎn)卵),是藥劑亞致死劑量刺激害蟲生殖的現(xiàn)象。亞致死劑量是指由于昆蟲個(gè)體對(duì)殺蟲劑的不同接觸程度以及所施用殺蟲劑的降解程度,在害蟲暴露于亞致死濃度或劑量的毒物時(shí),對(duì)該蟲生理或行為特征的影響,包括使害蟲神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育速度、產(chǎn)卵能力、壽命、免疫力、性比以及攝食行為等發(fā)生改變(Lüetal.,2021)。所以藥劑刺激昆蟲Vg表達(dá)量上調(diào)成為害蟲再猖獗發(fā)生的一條重要途徑。

1.1 卵黃原蛋白對(duì)昆蟲生殖的影響

迄今為止,已報(bào)道了200多種昆蟲Vg基因,部分見表1。昆蟲Vgs屬于大脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LLTP)超家族,由3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域組成,分別是脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LPD_N)、未知功能結(jié)構(gòu)域(DUF1943)、以及von Willebrand因子型D域(VWD)(Tufail and Takeda,2008)。大多數(shù)昆蟲Vgs中發(fā)現(xiàn)了一些特定的保守單元,如切割位點(diǎn)RXXR、功能位點(diǎn)GL/ICG和DGXR以及C端附近的保守半胱氨酸殘基,其中多絲氨酸束被認(rèn)為是昆蟲Vgs最顯著的特征(Miaoetal.,2021)。

表1 部分昆蟲Vg全長(zhǎng)序列信息

脂肪體中Vg的合成是雌性昆蟲卵黃發(fā)生的基礎(chǔ),決定著卵子成熟與胚胎發(fā)育的成功。對(duì)于大多數(shù)昆蟲的卵黃發(fā)生,涉及脂肪體產(chǎn)生和分泌Vgs或其他YPPs,并通過膜結(jié)合受體VgR介導(dǎo)的胞吞作用分泌到血淋巴中,再轉(zhuǎn)運(yùn)到正在生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中(Tufailetal.,2014)。進(jìn)入卵母細(xì)胞后,Vgs被水解、糖基化、脂化和磷酸化修飾加工后以卵黃蛋白(Vitellins,Vns)的形式儲(chǔ)存,為昆蟲的卵子發(fā)育提供能量?jī)?chǔ)備(Valerioetal.,2008)。在昆蟲營(yíng)養(yǎng)積累過程中,脂肪體內(nèi)Vg的表達(dá)水平增加,伴隨卵母細(xì)胞的發(fā)育,卵巢成熟,最后至性成熟而交配產(chǎn)卵(Tufail and Takeda,2008)。在昆蟲胚胎發(fā)育過程中,Vg是蛋白質(zhì)合成的氨基酸儲(chǔ)備(Royetal.,2018)。有研究發(fā)現(xiàn),沉默昆蟲Vg表達(dá)后會(huì)影響昆蟲體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),縮短生殖期,導(dǎo)致胚胎發(fā)育受到抑制,影響昆蟲產(chǎn)卵,甚至導(dǎo)致產(chǎn)生無效卵(Chaoetal.,2019)。

1.2 農(nóng)藥刺激昆蟲生殖的機(jī)制

1.2.1刺激雌蟲生殖的機(jī)制

藥劑刺激害蟲生殖的分子機(jī)制主要是影響與生殖相關(guān)的蛋白酶基因表達(dá)。它的調(diào)控機(jī)制為藥劑抑制保幼激素脂酶(juvenile hormone esterase,JHE)基因的表達(dá),但保幼激素(juvenile hormone,JHs)基因的表達(dá)量顯著上調(diào),致使成蟲體內(nèi)JH水平顯著提高,Vns表達(dá)量顯著上調(diào)。如吡蟲啉處理的三化螟Scirpophagaincertulas、二化螟Chilosuppressalis成蟲體內(nèi)JH和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)水平變化顯著,促進(jìn)卵黃發(fā)生的JH滴度顯著上升,使得二化螟、三化螟雌成蟲產(chǎn)卵量也顯著增加(Wangetal.,2005;Yuetal.,2007)。三唑磷與溴氰菊酯兩種殺蟲劑均能顯著誘導(dǎo)褐飛虱雌蟲交配后JHEmRNA的表達(dá),JH III滴度隨殺蟲劑濃度的增加而增加(Geetal.,2010)。亞致死濃度的氯蟲苯甲酰胺處理二化螟,所有發(fā)育階段處理組中的甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Juvenile hormone acid O-methyltransferase,JHAMT)和JH水平均顯著提高,表明氯蟲苯甲酰胺亞致死濃度可上調(diào)二化螟JH生物合成基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致JH水平升高,促進(jìn)卵黃發(fā)生增加產(chǎn)卵量(Xuetal.,2017)。

藥劑刺激害蟲生殖的調(diào)控是通過激活脂肪體合成Vg的RNA轉(zhuǎn)錄水平開始,亞致死劑量殺蟲劑會(huì)引起害蟲興奮效應(yīng),刺激昆蟲Vg表達(dá)。如長(zhǎng)期使用亞致死劑量甲維鹽處理草地貪夜蛾會(huì)使其產(chǎn)生抗性并促進(jìn)繁殖,雙三氟蟲脲處理甜菜夜蛾Spodopteraexigua3齡幼蟲,發(fā)現(xiàn)羽化后2 d和3 d的雌成蟲體內(nèi)SeVgmRNA表達(dá)水平顯著降低(楊范琴,2021;Hafeezetal.,2021)。最近,Gomaa等(2021)用病原菌芽孢桿菌Paenibacillus幼蟲飼喂蜂王后發(fā)現(xiàn)處理后蜂王的卵巢蛋白提取量顯著增加,Vg表達(dá)量更是比未處理組高20倍。亞致死劑量的三唑磷處理的褐飛虱雌蟲通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了Vg在褐飛虱雌成蟲中高表達(dá)。這表明殺蟲劑可以通過改變Vg的表達(dá)來調(diào)控飛虱的繁殖,從而影響種群密度(Geetal.,2011;Zhouetal.,2020)。

1.2.2刺激雄蟲生殖及交配傳導(dǎo)效應(yīng)

藥劑除了可刺激雌蟲生殖外,還可刺激雄蟲生殖并通過交配傳導(dǎo)信號(hào)給雌蟲進(jìn)而刺激雌蟲生殖。使用三唑磷和溴氰菊酯處理褐飛虱后可導(dǎo)致雄性附腺蛋白(Male accessory gland proteins,MAGs)水平升高,交配時(shí)更多的MAGs傳導(dǎo)給雌蟲,使得雌成蟲的脂肪體和卵巢中的卵黃素含量顯著升高,且藥劑處理后的Vg水平較對(duì)照組更高(Wangetal.,2010)。且與對(duì)照相比,雄蟲的JH III滴度在交配前升高,交配后降低,說明JH III通過交配轉(zhuǎn)移到雌蟲體內(nèi)(Geetal.,2010)。藥劑刺激雄蟲生殖的主要相關(guān)基因是精子發(fā)生相關(guān)蛋白(NISPATA5)。通過RNAi將褐飛虱雄蟲NISPATA5 抑制會(huì)導(dǎo)致其交配對(duì)象的脂肪體和卵巢蛋白含量降低,Vg表達(dá)降低,影響卵巢發(fā)育(Geetal.,2016)。

2 內(nèi)分泌激素對(duì)卵黃原蛋白影響進(jìn)而對(duì)昆蟲猖獗的調(diào)控作用

昆蟲對(duì)生殖的調(diào)控主要是激素對(duì)卵黃發(fā)生的調(diào)控作用,其中Vg的合成和成熟的卵母細(xì)胞對(duì)Vg的吸收等過程均由激素及激素間的級(jí)聯(lián)作用嚴(yán)密調(diào)控。過去10年的研究證明,雌性昆蟲生殖主要由保幼激素、蛻皮激素、神經(jīng)肽、胰島素(insulin)以及microRNAs調(diào)控(Khalidetal.,2021)。本文主要綜述激素對(duì)昆蟲生殖的調(diào)控。

2.1 保幼激素對(duì)卵黃原蛋白調(diào)控的分子機(jī)制

JH誘導(dǎo)脂肪體中的Vg合成,促進(jìn)卵泡上皮細(xì)胞間隙的開放,促進(jìn)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用從血淋巴選擇性攝取Vg,從而來調(diào)節(jié)雌性昆蟲的生殖能力(Santosetal.,2019)。JH通過JH受體基因(Methoprene-tolerant,Met)作用控制卵黃發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟。在直翅目東亞飛蝗Locustamigratoria中,RNAi介導(dǎo)的Met缺失可阻止JH誘導(dǎo)的Vg表達(dá),降低將Vg運(yùn)輸?shù)桨l(fā)育中的卵母細(xì)胞所需的卵泡細(xì)胞間的開放空間并阻止卵巢發(fā)育(Songetal.,2014)。同樣地,在蜚蠊目太平洋碩蠊Diplopterapunctata中,RNAi沉默Met會(huì)導(dǎo)致初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育受阻,Vg不再轉(zhuǎn)錄,也不再被卵巢吸收。Met還可參與調(diào)節(jié)性信息素的釋放,促進(jìn)性腺的發(fā)育,從而提高Vg的合成及卵巢對(duì)Vg的攝取(Marchaletal.,2017)。沉默赤擬谷盜Triboliumcastaneum中Met會(huì)導(dǎo)致1齡和2齡幼蟲的存活率顯著降低,甚至影響胚胎發(fā)育(Naruseetal.,2020)。此外,Krüppel homolo1(Kr-h1)是JH信號(hào)通路中下游關(guān)鍵應(yīng)答基因,Kr-h1缺失會(huì)阻礙卵巢的發(fā)育,同時(shí)也顯著降低產(chǎn)卵量(Yueetal.,2018;Heetal.,2020)。Taiman(Tai)也是bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,Met/Tai異源二聚體介導(dǎo)JH信號(hào),觸發(fā)Kr-h1,是誘導(dǎo)卵黃形成和產(chǎn)卵所必需的(Liuetal.,2018),沉默東亞飛蝗中的Tai-A會(huì)導(dǎo)致脂肪體中VgmRNA水平急劇下降到正常水平的1%,VgA和VgB轉(zhuǎn)錄本分別下降了91%和89%,并伴隨卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的停滯(Wangetal.,2017),JH誘導(dǎo)Met與Tai結(jié)合為功能復(fù)合體,調(diào)控Kr-h1的轉(zhuǎn)錄。將JHAMTdsRNA注射到赤擬谷盜雌性成蟲中成功地沉默JHAMT的表達(dá)后,雌蟲Vg表達(dá)量顯著下降,而又局部應(yīng)用JH刺激后,誘導(dǎo)了JHAMTRNAi雌蟲類胰島素肽(Insulin-Like Peptides,ILPs)編碼基因的表達(dá),并誘導(dǎo)Vg基因的表達(dá)。表明JH通過胰島素信號(hào)通路間接刺激Vg的產(chǎn)生(Shengetal.,2011)。

2.2 蛻皮激素對(duì)卵黃原蛋白調(diào)控的分子機(jī)制

研究表明脫皮激素(20E)可以直接或間接參與膜翅目、鱗翅目和所有雙翅目昆蟲Vg的產(chǎn)生,20E調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟,從而間接影響脂肪體內(nèi)Vg的合成。如蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum的卵黃發(fā)生主要受蛻皮激素調(diào)控,而JH只是起到輔助作用(Dongetal.,2007)。熊蜂BombusIantschouensis體內(nèi)的卵黃原蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的基因調(diào)控并且證明了在熊蜂中蛻皮激素能夠誘導(dǎo)Vg的轉(zhuǎn)錄(甄叢愛等,2019)。在褐飛虱Vg的潛在分子調(diào)控機(jī)制中,蛻皮激素應(yīng)答基因E74和1個(gè)重要的生殖力相關(guān)基因血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)與Vg基因表達(dá)調(diào)控有相關(guān)性。不同發(fā)育階段的褐飛虱,其高繁殖力群體中ACE的mRNA表達(dá)水平顯著高于低繁殖力群體,此外通過RNAi沉默ACE的表達(dá),會(huì)導(dǎo)致Vg表達(dá)水平降低,褐飛虱的繁殖力降低。后注射E74dsRNA后,發(fā)現(xiàn)ACE和Vg表達(dá)水平顯著降低,這表明蛻皮激素對(duì)Vg轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可能是由ACE通過ACE啟動(dòng)子區(qū)域的E74結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)的(Sunetal.,2017,2018)。20E調(diào)控級(jí)聯(lián)對(duì)雙翅目昆蟲的卵黃發(fā)生和卵子生成至關(guān)重要。蛻皮觸發(fā)激素(Ecdysis trigger hormone,ETH)是一種小型的c-末端酰胺化肽激素,由Inka細(xì)胞釋放,ETH信號(hào)作為變異體激素在維持雌性昆蟲正常JH水平、卵黃發(fā)生和生殖所需的JHAMT表達(dá)方面發(fā)揮著重要的功能(Ladislavetal.,2010)。人為使用20E可明顯增加昆蟲產(chǎn)卵量,在注射ETHdsRNA導(dǎo)致ETH、Vg和JHAMT表達(dá)量明顯降低的桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis中,體外局部注射20E,可提高ETH和ETHR的轉(zhuǎn)錄,也可以增加卵子的生產(chǎn)(Shietal.,2019)。20E缺失不僅導(dǎo)致ETH水平下降,還導(dǎo)致JH產(chǎn)量減少,而ETH的沉默則導(dǎo)致Vg和JH生物合成基因mRNA水平下降(Khalidetal.,2021)。

2.3 保幼激素和蛻皮激素共同調(diào)控卵黃原蛋白分子合成的分子機(jī)制

果蠅的卵子發(fā)生依賴于JH和20E的平衡調(diào)控(Solleretal.,1999)。在正常情況下,JH刺激脂肪體內(nèi)的卵黃蛋白合成。在卵巢中,JH與其他因素聯(lián)合促進(jìn)卵黃蛋白內(nèi)吞,使卵母細(xì)胞發(fā)育。合成和攝取的組合作用促使成熟卵母細(xì)胞足夠的卵黃沉積,維持了正常的卵黃發(fā)生進(jìn)程(Yamamotoetal.,2013;Seidelmannetal.,2016)。在埃及伊蚊Aedesaegypti中,發(fā)現(xiàn)ETH可激活JHAMT,進(jìn)而使Vg的表達(dá)顯著上升(Areizaetal.,2014)。調(diào)控ETH基因表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵上游信號(hào)是20E。在桔小實(shí)蠅的RNAi實(shí)驗(yàn)中,ETH信號(hào)的缺失會(huì)導(dǎo)致JH水平急劇下降、降低Vg的合成,進(jìn)而導(dǎo)致卵巢體積縮小、卵子產(chǎn)量和成熟卵母細(xì)胞卵黃沉積的減少,進(jìn)而抑制雌蟲的產(chǎn)卵量,注射JH類似物烯蟲酯可使Vg表達(dá)量上升,增加產(chǎn)卵量。在上游注射20E,可使ETH轉(zhuǎn)錄,促使雌蟲產(chǎn)卵(Shietal.,2019)。可知,20E、ETH和JH構(gòu)成了部分昆蟲正常生殖生理所必需的激素網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)控Vg的合成。

2.4 神經(jīng)肽對(duì)卵黃原蛋白的調(diào)控

激脂激素(Adipodynamic hormone,AKH)是昆蟲心肌細(xì)胞合成的神經(jīng)激素,能動(dòng)員脂肪和碳水化合物進(jìn)行包括生殖在內(nèi)的能量消耗活動(dòng),AKH激脂激素受體AKHR通路參與促進(jìn)卵黃發(fā)生過程(Attardoetal.,2012;Zandawalaetal.,2015)。近年,越來越多的研究表明,AKH/AKHR信號(hào)系統(tǒng)對(duì)雌性生殖力具有正向刺激作用(鄭洪遠(yuǎn)和范書凡,2021)。如利用RNA干擾褐飛虱雌蟲AKH基因,可觀察到Vg在血淋巴中的積累增加,而在卵巢中的沉積減少,表明雌性生殖過程中AKH/AKHR信號(hào)系統(tǒng)在卵黃發(fā)生過程中起作用(Luetal.,2019)。飛蝗Locustamigratoria中AKH III主要在卵黃發(fā)生和卵成熟過程中起營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用,成年雌蟲每日注射AKH Ⅲ可刺激卵黃發(fā)生和卵子發(fā)育。相反,RNA干擾介導(dǎo)的AKHR沉默導(dǎo)致脂肪體中Vg表達(dá)顯著降低,卵巢中Vg沉積減少。目前推測(cè)AKH/AKHR信號(hào)可能是通過三酰基甘油動(dòng)員和海藻糖穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)卵巢對(duì)Vg的攝取(Zhengetal.,2020)。

昆蟲鞣化激素(Bursicon)是由神經(jīng)系統(tǒng)分泌的一種異源二聚體神經(jīng)肽,除對(duì)昆蟲表皮鞣化、展翅等功能具有調(diào)控作用外,還參與調(diào)節(jié)Vg的表達(dá)。在家蠶BombyxmoriRNA干擾實(shí)驗(yàn)中,干擾Bursicon基因后,家蠶Bursicon基因表達(dá)量顯著下調(diào),其相關(guān)基因BmVg的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組。表明Bursicon可以參與調(diào)節(jié)Vg等生殖相關(guān)基因,從而影響家蠶的繁殖能力(楊佳鵬等,2021)。

2.5 胰島素對(duì)卵黃原蛋白調(diào)控的分子機(jī)制

胰島素(ILP)是一類在生物體內(nèi)具有調(diào)控生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖等功能的肽類激素,昆蟲中以類胰島素類型存在(N?ssel and Broeck,2016)。越來越多的研究證明,在昆蟲卵黃發(fā)生階段,ILP也參與昆蟲Vg表達(dá)過程。埃及伊蚊ILPs可促進(jìn)其卵巢產(chǎn)生蛻皮激素和卵母細(xì)胞吸收卵黃蛋白(Valzaniaetal.,2019)。將牛胰島素注射到昆蟲Vg合成前、饑餓或保幼激素缺失的成蟲雌性體內(nèi),可以提高Vg轉(zhuǎn)錄和蛋白水平,表明ILPs參與了Vg合成的調(diào)控,并且其卵巢發(fā)育及繁殖能力均有顯著提高(Zhangetal.,2017a)。RNAi豆莢螟蟲MarucavitrataILP,幼蟲表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)遲緩,成年雌性卵巢發(fā)育被抑制(Al Bakietal.,2019)。在大草蛉Chrysopaseptempunctata中干擾PI3K通路中的關(guān)鍵基因Akt,中斷了胰島素信號(hào),限制了卵巢的發(fā)育(Zhangetal.,2017b)。在東亞飛蝗中通過干擾關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子ERK,抑制了飛蝗脂肪體中Vg的mRNA和蛋白表達(dá),表明ERK在飛蝗卵黃發(fā)生過程中起著重要作用(李東,2018)。在赤擬谷盜雌性成蟲中,JH-Met和飼喂?fàn)I養(yǎng)物都可以誘導(dǎo)腦和脂肪體產(chǎn)生特異的ILPs。ILPs通過Akt使叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子FOXO磷酸化,導(dǎo)致FOXO出核,從而引發(fā)Vg合成(Shengetal.,2011)。表明類胰島素及其通路其不僅能直接調(diào)控昆蟲生殖活動(dòng),還能與蛻皮激素和JH互作起著協(xié)同調(diào)控作用。

3 卵黃原蛋白作為殺蟲劑新靶標(biāo)在昆蟲猖獗治理中的應(yīng)用

3.1 昆蟲卵黃原蛋白R(shí)NA干擾技術(shù)的研究現(xiàn)狀

Vg是調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和其他行為的關(guān)鍵基因,其合成具有性別、組織、發(fā)育期的特異性,并受激素調(diào)節(jié),是一種研究基因表達(dá)與調(diào)控的良好模式系統(tǒng)。RNA干擾造成Vg合成受阻后,引起昆蟲雌蟲死亡率的顯著升高,抑制昆蟲卵母細(xì)胞成熟和卵細(xì)胞的產(chǎn)生,卵巢形態(tài)發(fā)育異常,昆蟲的產(chǎn)卵量降低,進(jìn)而影響種群數(shù)量的增長(zhǎng)。表明Vg可以通過RNAi靶向控制害蟲,成為害蟲防治研究的重要切入點(diǎn)之一,亦可作為昆蟲控制的精確靶點(diǎn)(Mitchelletal.,2019;Husainetal.,2020)。以此靶標(biāo)開發(fā)新型殺蟲技術(shù),可為害蟲防治提供一個(gè)新的方向。

飼喂體外合成的dsVg可顯著抑制嗜蟲書虱Vg的轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致卵巢發(fā)育不充分,降低產(chǎn)卵能力和卵孵化率(Miaoetal.,2021)。將dsVg注射到異色瓢蟲Harmoniaaxyridis體內(nèi),結(jié)果顯示Vg基因被特異性沉默,其相對(duì)表達(dá)量明顯降低,產(chǎn)卵總數(shù)與孵化率低于對(duì)照組(Chaoetal.,2019)。使用顯微注射法將dsRNA注射到白背飛虱Sogatellafurcifera雌蟲體內(nèi),注射后的白背飛虱雌蟲卵巢發(fā)育被抑制,不能產(chǎn)下卵粒。解剖發(fā)現(xiàn),卵巢發(fā)育被抑制(鄧瑤,2018)。家蠶Vg在雌蟲中特別高表達(dá),通過RNAi下調(diào)Vg基因,會(huì)影響昆蟲卵的數(shù)量和顏色,干擾卵的形成和胚胎的發(fā)育,后用性類固醇17-β-雌二醇處理后,Vg在體內(nèi)和體外均上調(diào)(Yangetal.,2014)。這都證明了Vg在昆蟲卵的形成和胚胎發(fā)育中舉足輕重的作用。Vg可作為未來進(jìn)行害蟲控制與防治靶標(biāo)候選基因的潛力之一。干擾目標(biāo)害蟲的Vg,不僅可以抑制其猖獗危害問題,通過減少繁殖來控制害蟲數(shù)量(Alietal.,2017)。

3.2 昆蟲卵黃原蛋白沉默技術(shù)的實(shí)踐意義

RNAi昆蟲Vg可以通過沉默Vg基因、阻止卵巢發(fā)育、降低害蟲產(chǎn)卵量的生殖隔斷技術(shù)來防止害蟲猖獗現(xiàn)象的發(fā)生,是一種開發(fā)周期短、操作簡(jiǎn)單、特異性高、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)的靶向型害蟲防治技術(shù)。作為新型防治技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治具有巨大潛力。但是目前對(duì)于RNAi技術(shù)的應(yīng)用存在多處問題:昆蟲間RNAi效率不穩(wěn)定及易降解、缺乏可靠的dsRNA傳遞方法、脫靶和非靶標(biāo)效應(yīng)以及昆蟲種群中潛在的抗性發(fā)展等。

針對(duì)于RNAi的沉默效率及易降解問題,相較于其他昆蟲,鱗翅目昆蟲RNAi效率因大部分dsRNA進(jìn)入蟲體會(huì)被中腸或血淋巴中的相關(guān)核酸酶降解,使其不能進(jìn)入RNAi途徑發(fā)揮沉默靶標(biāo)基因的功能,且dsRNA被細(xì)胞吸收的效率較低,RNAi關(guān)鍵蛋白表達(dá)量低。目前已有用殼聚糖、脂質(zhì)體、陽離子樹狀大分子等納米顆粒遞送dsRNA/siRNA,此技術(shù)可免受環(huán)境中核酸酶的降解,并促進(jìn)其跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)揮高效的基因干擾功能,增強(qiáng)其細(xì)胞攝取,進(jìn)而提高干擾效率。Zhang等(2010)首次用殼聚糖介導(dǎo)的dsRNA飼喂顯著提高了岡比亞按蚊Anophelesgambiae的RNAi效率。使用涂有受體特異性配體的脂質(zhì)體或無機(jī)納米顆粒等有機(jī)納米載體,可以保證VgdsRNA在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性,提高dsRNA的遞送效率(王曉迪等,2020)。納米技術(shù)與基因沉默已在其他昆蟲及基因中得到研究,殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)生成與dsRNA的納米級(jí)聚電解質(zhì)復(fù)合物,增大了埃及伊蚊幼蟲死亡率和基因沉默效率(Dhandapanietal.,2019),以納米粒子為載體,可有效防止dsRNA在昆蟲體內(nèi)被核酸酶降解,保護(hù)dsRNA安全到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)后有效釋放并發(fā)揮RNAi作用。提高dsRNA的遞送效率,可利用多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PTD-DRBD)融合蛋白,高效地將siRNA傳遞到細(xì)胞中(Eguchietal.,2009)。此外,在遞送中,可用凝集素替代PTD,生成凝集素-DRBD融合蛋白是可行的,攜帶DRBD結(jié)合的dsRNA的凝集素融合可能會(huì)增強(qiáng)dsRNA在腸道的攝取,對(duì)棉鈴蟲有很好的致死效應(yīng)(Ohizumietal.,2009)。

微注射可精確對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行干擾但無法大規(guī)模應(yīng)用于害蟲防治。對(duì)于飼喂傳遞,使用表達(dá)dsRNA的工程菌也是一個(gè)常見的施用dsRNA的方法,可以將dsRNA構(gòu)建體克隆到細(xì)菌酵母質(zhì)粒中來大量生產(chǎn)。或用轉(zhuǎn)基因植物來沉默特定害蟲的Vg,增加死亡率,來阻止猖獗現(xiàn)象的發(fā)生(Ibrahimetal.,2017),基于工程菌高效合成靶向昆蟲dsRNA的技術(shù)為田間噴灑、根灌推廣提供了可行性及技術(shù)支撐。也可通過土壤灌溉和樹干注射來傳遞dsRNA溶液(Ghoshetal.,2018)。dsRNA可被制備成用于噴霧或灌溉施用的制劑,應(yīng)用在大面積的農(nóng)作物上等,因此可以選擇性地針對(duì)害蟲(Wangetal.,2011)。但以上技術(shù)目前存在的最大障礙是安全性問題,而這需要更多的深入研究來確定其對(duì)于人類、環(huán)境和其他非靶標(biāo)生物的潛在威脅。

脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致應(yīng)用RNAi進(jìn)行昆蟲功能基因組學(xué)研究產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論,如果利用RNAi進(jìn)行害蟲防治出現(xiàn)脫靶效應(yīng),就會(huì)因?yàn)榘袠?biāo)的非特異性而出現(xiàn)嚴(yán)重的環(huán)境安全性問題,甚至影響人類健康,目前還沒有更好的辦法去避免這個(gè)問題。害蟲可以通過多種機(jī)制產(chǎn)生對(duì)RNA農(nóng)藥的抗性,包括靶基因或核心RNAi機(jī)制基因的突變、序列多態(tài)性、增強(qiáng)的dsRNA降解和減少的dsRNA攝取(Zhu and Palli,2020)。

4 小結(jié)和展望

近些年來,科學(xué)家們就昆蟲的猖獗危害、卵黃原蛋白與昆蟲的生理猖獗機(jī)制、RNA干擾技術(shù)在昆蟲猖獗治理中的應(yīng)用等進(jìn)行了大量的研究工作,但如何將昆蟲Vg作為害蟲防治靶點(diǎn)的實(shí)際性操作技術(shù)仍有待深入探討:1)如何解決鱗翅目昆蟲對(duì)RNAi的低敏感性;2)如何使dsRNA能在不影響非靶物種的情況下,以高保真度靶向合適的轉(zhuǎn)錄本;3)如何解決Dicer對(duì)不同種昆蟲中對(duì)dsRNA進(jìn)行剪切的不同形式;4)如何做到在低成本的條件下廣泛開發(fā)使用相關(guān)藥劑,如昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;5)VgdsRNA技術(shù)是否可以廣泛使用,會(huì)不會(huì)對(duì)生態(tài)多樣性產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的危害?

雌性昆蟲生殖過程中的Vg基因作為達(dá)到有效利用RNAi技術(shù)防控害蟲的目的的有效靶基因,在了解害蟲猖獗機(jī)制和作為害蟲防治靶點(diǎn)的巨大潛力受到廣泛的研究,為從新型生物技術(shù)方面提供防治止昆蟲猖獗及再猖獗的生物農(nóng)藥的新靶標(biāo)奠定理論依據(jù)。通過基因編輯技術(shù)沉默害蟲Vg基因,使得昆蟲變態(tài)失敗致死或生殖力低下,大幅度降低昆蟲產(chǎn)卵量,有效地減少害蟲數(shù)量,同時(shí)這項(xiàng)技術(shù)還可避免因過量使用化學(xué)殺蟲劑帶來的生物多樣性銳減、生態(tài)平衡破壞等問題,從而減少農(nóng)林業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。