超高效液相色譜串聯質譜法同時測定當歸補血湯中6 種成分含量

胡燕梨，譚麗盈，盧秋桃，賴燕芬

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510400）

近年來，隨著國家對中醫藥產業支持力度的逐漸加大，中藥新藥研發展現出蓬勃生機，尤其在2021 年，中藥新藥批準文件達12個，創6年來新高，且含3個按古代經典名方加減組方的中藥復方制劑。可見，中藥經典名方也是目前中藥新藥研究的熱點。目前對經典名方當歸補血湯的研究多集中在臨床配伍、藥理、臨床數據統計、網絡藥理學等方面［1-4］，涉及質量控制的報道較少，為此，本研究中參考文獻［5 - 7］，建立了同時測定當歸補血湯中當歸和黃芪藥材中阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷含量的超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法，為提高其質量標準提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY H - Class 型超高效液相色譜儀，Xevo TQD 型三重四極桿質譜儀，含FTN 全自動進樣器、QSM四元溶劑管理器（美國Waters 公司）；KQ - 500DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ML204T 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；100 μL、200 μL、1 mL可調式移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號為110773 - 201915，含量99.4%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201503，含量98.3%），黃芪甲苷對照品（批號為110781-201717，含量96.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；藁本內酯對照品（成都曼斯特公司，批號為Must -17041012，含量99.50%）；芒柄花素對照品（批號為DST190501-011，含量98.9%），毛蕊異黃酮對照品（批號為DST200915-012，含量98.0%），均購自成都樂美天醫藥科技有限公司；乙腈、甲醇（液質聯用級）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。黃芪藥材的批號與產地分別為191201（內蒙古），200301（甘肅），200501（陜西），當歸藥材的批號與產地分別為200201（甘肅＜岷縣＞），200601（四川），D200802（云南），兩者分別經醫院梁文能副主任藥師鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels及豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao。將不同批2種藥材分別組方，得9批樣品（表1）。

表1 樣品及藥材批號Tab.1 Batch numbers of samples and medicinal materials

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時28%A→38%A，10～13 min時38%A→60%A，13～14 min 時60%A→28%A，14～16 min 時28%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應監測模式（MRM）采集；正負離子模式監測掃描（僅阿魏酸為負離子模式）采集；碰撞氣為氬氣；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓3.0 kV；去溶劑氣流量700 L/h；去溶劑氣溫度350 ℃。6種成分質譜采集參數見表2。

表2 各成分的質譜采集參數Tab.2 Mass spectrum parameters of each component

2.2 溶液制備

取阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為50.62，80.34，30.06，60.23，33.65，102.38 μg/mL 的混合對照品溶液。取當歸藥材樣品8 g，黃芪藥材樣品40 g，精密稱定，加8倍量水（約400 mL），浸泡30 min，煎煮40 min，趁熱過濾，定容至200 mL，冷凍保存，作為基準樣品；取1 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按當歸補血湯的處方及工藝，分別制備不含當歸和黃芪的單一陰性樣品，冷凍保存，使用時按供試品溶液制備方法制得2種陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗與專屬性試驗：分別取2.2項下4種溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處出現相應色譜峰，理論板數按各成分峰計均應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對照無干擾，表明方法的專屬性良好。詳見圖1。

圖1 總離子流圖1.Calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside 2.Ferulic acid 3.Calycosin 4.Formononetin 5.Astragaloside Ⅳ 6.LigustilideA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Angelicae Radix D.Negative reference solution lacking Astragali RadixFig.1 Total ion chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，得系列混合對照品溶液。精密量取2 μL，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見表3。

表3 線性關系考察結果Tab.3 Results of the linear relation test

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S/N）分別為3∶1 和10∶1 時各待測成分質量濃度作為檢測限和定量限，結果阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷的檢測限分別為0.155，0.247，0.092，0.185，0.103，0.315 μg/ kg，定 量 限 分 別 為0.518，0.823，0.308，0.617，0.344，1.050 μg/kg。

精密度試驗：取同一混合對照品溶液適量，按2.1項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.32%，3.87%，2.68%，3.52%，1.43%，3.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，室溫下分別于0，1，2，4，8，12，16，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為4.01%，3.52%，2.78%，3.35%，2.69%，4.15%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取2.2項下基準樣品1 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果樣品中阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷的含量分別為0.705 2，11.325 5，1.722 1，1.538 2，1.240 4，2.128 6 μg/g，RSD分別為2.51%，1.68%，1.27%，2.38%，2.97%，3.18%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量基準樣品，共6份，分別加入阿魏酸、藁本內酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷對照品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取各批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進樣測定，平行3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表5。

表5 樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.5 Results of the content determination of six components in the samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 研究背景

2018 年，國家中醫藥管理局公布了《古代經典名方目錄（第一批）》，共100首，當歸補血湯為第51首，該方源于《內外傷辨惑論》，由黃芪和當歸兩味藥按5∶1（m/m）組方，為益氣補血養陰名方［8］，原方記載：“黃芪一兩，當歸二錢（酒洗），上件咀，都作已服，水二盞煎至一盞，去渣，溫服，空心食前。治肌熱，燥熱，困渴引飲，目赤面紅，晝夜不息。其脈洪大而虛，重按全無?！庇捎诠糯挠嬃抗ぞ呒帮嬈呐谥埔幐?、劑量及煎煮方式均與現代有差異，故明確處方中的關鍵信息，對于開發當歸補血湯具有重要意義。當歸中主要含有機酸、萜類、揮發油等［9-11］，其中阿魏酸能抑制血小板聚集［12］，藁本內酯有抑制子宮平滑肌收縮等作用［13］；黃芪主要成分為黃芪皂苷類、黃酮及其苷類化合物，此外還有有機酸和多糖類成分，這些成分均具有調節免疫、抗腫瘤和保護心血管的作用［14-17］。

目前主要有當歸補血湯中單一或兩三種成分含量測定、指紋圖譜、化學成分和微量元素的研究［18-20］，未見多種成分同時測定方法的報道，由于古代經典名方主要為水提液，傳統的液相色譜在水提液分離方面效果不佳，干擾較大，且黃芪甲苷在紫外吸收中屬末端吸收，測定時干擾較大，響應較低，故與其他成分同時測定時只能采用液質聯用法，液相色譜串聯質譜可采用獨特的MRM 掃描方式，對目標化合物進行定性和定量分析，選擇性強，靈敏度高，多用于此類研究。

3.2 指標成分選擇

阿魏酸、藁本內酯是當歸藥材發揮藥效的主要活性成分，阿魏酸具有擴張血管，抗腫瘤和增強免疫的作用，藁本內酯可抑制子宮平滑肌收縮，芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和黃芪甲苷是黃芪藥材中的主要黃酮及其苷類化合物，是其質量控制的關鍵指標。芒柄花素具有改善動脈粥樣硬化病變，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮同時具有清除氧自由基/抑制血管平滑肌細胞增殖的作用，黃芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗氧化和保護心腦血管的藥理作用，其作用均與當歸補血湯的藥理作用密切相關。由于中藥發揮作用是多靶點多作用機制的綜合表現，因此同時測定當歸補血湯中多種成分含量更利于對其進行質量控制和全面評價。

3.3 試驗條件選擇

組分成分測定中常采用梯度洗脫進行分離。預試驗中考察流動相時首先分有機相（甲醇和乙腈）與水相（0.1%甲酸溶液和0.1%乙酸銨溶液）進行考察，發現0.1%乙酸銨溶液- 甲醇（或乙腈）在正離子模式采集下阿魏酸、芒柄花素的色譜峰形拖尾，當采用甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸水溶液時，當歸補血湯中6個成分的色譜峰均可良好分離，乙腈-0.1%甲酸水溶液出峰時間較短，且響應值較高，故以此為流動相。色譜柱分別考察了Agilent SB C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），Waters BEH C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）和Shimadzu Shim - pack GIST C18AQ HP 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），結果各成分色譜峰均分離良好，可以準確進行定量，表明該方法的耐用性良好。其后根據6 個成分的前體離子在正（或負）離子模式下確定毛細管和錐孔的電壓，脫溶劑氣的流速及溫度，再優化碰撞能量，通過調整碰撞電壓，共優化2個子離子，選擇響應強度最高、穩定性好的離子作為定量離子，另一個作為定性離子，可保證測定結果的準確性。

3.4 結果分析

本研究結果顯示，9 批樣品中6 種成分的含量波動范圍均符合《古代經典名方中藥復方制劑物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》要求的均值±30%之間。但本試驗中所測樣品均為實驗室小試樣品，且所制備樣品批數較少，黃芪和當歸藥材的產地及信息偏少，樣品為隨機組方制備，測定值不能全面反映2種藥材的質量信息。對于經典名方的研究至少應包含道地產區和主產區的藥材，本研究中在選擇時也遵循了上述原則，采用了甘肅當歸和內蒙古黃芪進行試驗，結果顯示，采用不同產地黃芪、當歸組方制備時，當歸補血湯中6 種成分的含量具有一定差異，因此，樣品制備中應考慮藥材的產地信息，進行多批次多產地藥材的收集，從而保證樣本的代表性，同時應結合臨床藥效結果，優選最佳藥材產地組方，從而保證當歸補血湯的質量可控，為制劑的進一步開發提供參考。

3.5 小結

在古代經典名方的開發研究中，一定要在遵循古代的制法基礎上用歷史和創新的思維對其劑量、炮制、基源等進行考證。本研究中所建UPLC - MS/ MS 法操作簡單，專屬性、重復性、穩定性和回收率均符合要求。相比目前報道的液相色譜法，具有靈敏度更高，分析速度快的優點，并且9批樣品各成分含量基本符合中藥經典名方含量波動的規定范圍。然而，經典名方及其制劑的開發要建立全過程（藥材- 飲片- 基準樣品- 中間體-復方制劑）質量控制體系，應適時建立指紋圖譜（或特征圖譜）并結合含量測定方法對其進行控制和監測，從而保證其質量的可控性和穩定性，但目前對當歸補血湯物質基礎成分與作用機理的研究較少，下一步需進行飛行時間（Q-TOF）或離子阱（Q-Trap）質譜及藥理實驗研究，從而為更好地提升當歸補血湯的質量標準及其相關制劑的后續研究開發提供依據。