抗原呈遞相關基因在銀屑病皮損中的表達研究

楊凡芮，韓建文

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010000；2.內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010000）

銀屑病是一種多因素誘發的免疫性疾病。特征性皮損是境界清楚、上附銀白色鱗屑的紅色斑塊，局限或廣泛分布。中國患病率為 0.47%，且呈現逐年增高趨勢［1］。銀屑病的發病機制極其復雜，包含免疫、遺傳、環境等多種因素。目前已有越來越多的研究表明抗原呈遞所引起的免疫因素在其發病過程中尤為重要，遺傳學及免疫學研究發現：參與抗原呈遞的一些相關基因（如HLA-C、ERAP1、CD1a）與銀屑病的發病機制具有密切的關系。本研究擬以尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PsV）和泛發性膿皰型銀屑?。╣eneralized pustular psoriasis，GPP）患者為對象，研究皮損中ERAP1、HLA-C、CD1a 的表達水平，與健康對照的皮膚組織進行比較。探討3 種基因在2 種類型銀屑病中的表達及其在銀屑病中的致病作用。

1 資料和方法

1.1 病例資料 選擇2014 年至2019 年就診于內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科，經組織病理確診的38例PsV 患者和21 例GPP 患者，所有患者取材前3 個月未經任何治療，無系統性疾病、結締組織疾病及腫瘤；并選取33 名健康人皮膚組織為對照組，3 組間的性別及年齡無統計學差異，見表1。所有實驗標本為石蠟包埋組織。本研究通過醫學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

表1 研究對象的性別、年齡基本特征［±S/n（%）］

表1 研究對象的性別、年齡基本特征［±S/n（%）］

1.2 試劑 標準化免疫組化試劑盒，包括一抗（兔抗人ERAP1、HLA-C、CD1a 抗體），二抗（山羊抗兔血清）、顯色劑等，購自Solarbio 公司。石蠟、甲醛、二甲苯等試劑購自上海國藥集團。

1.3 方法

1.3.1 實驗方法 所有標本均經福爾馬林溶液固定48 小時，常規洗滌與脫水，石蠟包埋，（4～7）μm 厚切片，撈片于處理過的防脫片上，60 ℃烤干，4 ℃保存備用。具體操作按產品說明書進行，已知陽性對照及陰性對照均來自于我院皮膚科就診人群，PBS 代替一抗作空白對照。免疫組化使用 Envision二步法，DAB 顯色，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。通過顯微鏡拍照，采集樣本相關部位，蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出的陽性表達為棕黃色。

1.3.2 結果評定 免疫組化染色后的病理片利用Image-pro plus 6.0 軟 件（Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA）進行圖像分析，選取相同的棕色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片IOD 值代表平均蛋白表達強度。陽性細胞比值=陽性面積/照片總面積。每張切片選擇3 個視野取平均值作為最終統計用。

1.4 統計學方法 應用SPSS26.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布的采用均數±標準差（±SD）表示，多組間的比較采用方差分析，不符合正態分布的資料采用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，多組獨立樣本比較選用Kruskal-Wallis秩和檢驗，進一步多組間兩兩比較選用兩個獨立樣本的Mann-Whitney U 檢 驗（α ＜0.017）。HLA-C、ERAP1、CD1a 表達之間的相關性采用Spearman 相關分析，以檢驗水準 P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

HLA-C 在PsV 組、GPP 組、對照組中的陽性細胞比值分別為0.09（0.06，0.13）、0.05（0.02，0.08）和0.07（0.04，0.10），差異有統計學意義（P＜0.05）。兩兩比較，PsV 與GPP 組的差異有統計學意義（P ＜0.05）（表2）。3 組中的HLA-C 的平均蛋白表達強度IOD 值分別為157834.49（98023.56，215894.83）、86193.29（38543.91，142187.79）、111118.73（59200.77，141852.99），差異有統計學意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對照組、PsV 與GPP 組的差異有統計學意義（P ＜0.05）（表3）。

表2 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮損中表達的陽性細胞比值［M（P25，P75）］

表3 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮損中熒光平均蛋白表達強度IOD 比較［M（P25，P75）］

ERAP1 在PsV 組、GPP 組、對照組中的陽性細胞比值分別為 0.13（0.06，0.18）、0.10（0.06，0.13）、0.03（0.02，0.05），差異有統計學意義（P ＜0.05）。兩兩比較，PsV 與對照組、GPP 與對照組間的差異有統計學意義（P ＜0.05）（表2）。ERAP1 的平均蛋白表達強度IOD 值分別為192091.46（77072.75，258680.10）、100684.51（87829.41，194942.43）、37534.33（21187.75，70946.6583），差異有統計學意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對照組、GPP 與對照組間的差異有統計學意義（P ＜0.05）（表3）。

CD1a 在PsV 組、GPP 組、對照組中的陽性細胞比值分別為0.02（0.00，0.09）、0.01（0.00，0.03）、0.00（0.00，0.01），差異有統計學意義（P ＜0.05）。兩兩比較中，PsV 與對照組有統計學意義（P ＜0.05）（表2）。CD1a 的平均蛋白表達強度IOD 值分別為31494.78（4783.86，154509.35）、12090.99（6349.54，61491.74）、3714.05（1201.07，19573.10），差異有統計學意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對照組有統計學差異（P ＜0.05）（表3）。

為分析這3 種基因在皮損中表達的相關性，在PsV組中利用Spearman 相關進行分析。結果表示HLA-C 與CD1a 熒光IOD 值具有相關性（rs=0.370，P=0.022）（圖1a）；ERAP1與CD1a熒光IOD值具有相關性（rs=-0.383，P=0.018）（圖1b）；ERAP1 與HLA-C 熒光IOD 值無相關性（rs=-0.012，P=0.943）（圖1c）。

圖1 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV 皮損中表達的相關性分析

3 討論

銀屑病是一種以 T 細胞介導的角質細胞增殖為特征的自身免疫性皮膚病，其發病機制目前尚不清楚。根據銀屑病的臨床特征，可分為尋常型、膿皰型、關節型和紅皮病型銀屑病，其中 PsV 占90%以上，GPP 較少見，可由PsV 發展而來并威脅人類生命健康［2］。

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是細胞表面主要組織相容性復合物（Major histocompatibility complex，MHC）的表達產物，具有高度多態性，可以改變內源性抗原呈遞途徑中與MHC-Ⅰ分子上同T 細胞受體（T cell receptor，TCR）結合的部位［3］。PSORS1 是銀屑病的一個強遺傳危險因素，該區域的HLA-Cw6 被公認為是與銀屑病易感基因關聯最強的等位基因之一。鑒于HLA-Cw6 在內源性抗原呈遞途徑中的作用，它可能與銀屑病自身抗原有高度親和力，諸如：LL-37 與黑素細胞的抗原（ADAMTSL）5 作為自身抗原支持T 細胞在銀屑病發病機制中的中心作用［4］。許瓊瓊等［5］研究發現HLA-C*06：02 和rs118179173 之間的顯著相互作用，以及HLA-C*06：02 與HLA-B：AA67 之間的顯著交互作用。還驗證了先前報道的基因相互作用，其中HLA-C 和ERAP1 之間的相互作用最為顯著。

ERAP1 在內源性抗原呈遞過程中起剪切作用，具有高度多態性，天然存在的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）稱為ERAP1 單倍型［6］。已經有許多國內外的學者研究發現，其蛋白產物之間存在多種氨基酸變化，使酶構象發生改變，從而影響酶的活性和底物結合。ERAP1 不同結構和位置的變異會導致異常多肽的出現，這些異常肽呈遞給HLA等位基因時，會影響細胞免疫表達，并激活自身炎癥級聯反應從而導致銀屑病的發生發展［7］。Arakawa等［8］研究發現ERAP1 風險單倍型增加產生依賴ERAP1 的自身抗原，增加了由HLA-C*06：02 呈遞黑素細胞自身抗原的可能性，從而超過潛在自身反應性T 細胞的激活閾值，從而觸發CD8+T 細胞介導的自身免疫性疾病。

此外，有證據表明朗格漢斯細胞在銀屑病發病機制中發揮關鍵作用，具有CD1a 的組成性高表達和向T 細胞呈遞脂質抗原的能力。自身抗原磷脂酶A2組IVD（PLA2G4D）有助于產生花生四烯酸等脂質代謝產物，參與銀屑病皮損中非蛋白脂類自身抗原的產生。CD1 蛋白是一類非多態性抗原呈遞分子，其編碼基因位于 MHC 基因位點之外，該蛋白能夠將來自自身和病原體的脂質及小分子物質作為抗原呈遞給T 細胞，并激活相應的免疫反應。在銀屑病患者中，血液中CD1a 限制性自身反應性T 細胞的數量比銀屑病患者的非皮損區皮膚組織和健康對照皮膚中的增加。它們以CD1a 依賴的方式對PLA2G4D 產生的脂肪酸和溶血磷脂做出反應，產生IL-17A、IFN-γ 和IL-22［9］。肥大細胞是PLA2G4D 的主要細胞來源，它衍生的外質體將PLA2G4D 輸送至樹突狀細胞。這些結果指出了更廣泛的銀屑病炎癥模型，脂質抗原在銀屑病的發展中也可能是有意義的自體抗原，外質體可以將潛在的脂質配體運輸到鄰近的抗原呈遞細胞［10］。

先前的研究報道了HLA-C、ERAP1 的基因變異在不同人種中與PsV 關聯的不同結果，強調了它們在該疾病發病機制中的重要性［11-13］。ERAP1 基因變異僅在攜帶HLA-C 等位基因的人群中與PsV 易感性相關。遺傳研究和薈萃分析發現，ERAP1 基因變異與PsV 具有明顯相關性［14］。Yanjie Fu［15］等人研究發現ERAP1 基因上SNP rs26653 可能與中國漢族人群的PsV 易感性呈正相關。Ji Hyung Kim［16］等人通過使用CD1a 轉基因小鼠，證明了CD1a 控制銀屑病的炎癥反應。上述遺傳學和免疫學證據均提示HLA-C、ERAP1、CD1a 是PsV 的重要關鍵分子，本研究發現在PsV 患者皮損中HLA-C、ERAP1、CD1a呈現高表達，證實3 種基因在銀屑病中的重要作用。本研究結果表明HLA-C 與CD1a 蛋白表達強度呈正相關，ERAP1 與CD1a 蛋白表達強度呈負相關，提示這些基因之間存在潛在的相互作用，并非獨立發揮作用。此外我們還發現GPP 患者的皮損中ERAP1 也呈高表達，并且與PsV 類似，提示抗原呈遞在膿皰型銀屑病的發病機制中可能也具有重要的作用。

我們的研究顯示了HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 和對照組中的蛋白表達，表明抗原呈遞相關基因與銀屑病的發生發展存在密切聯系。但是仍需要更深入的研究來明確它們在銀屑病發生、發展中的確切機制，以及抗原呈遞在銀屑病中的具體作用和可能的始動因素，為以后銀屑病的預防、治療提供幫助。