不同試驗條件對綿羊沖胚效果的影響

高峰　李心海

摘要 湖羊是江浙地區常見的綿羊品種之一，繁殖性能優越，肉質鮮嫩，營養豐富，為了進一步探索湖羊的繁殖潛力，采用CIDR+PMSG+PG+FSH法對湖羊進行同期發情和超數排卵，并在此基礎上對發情母羊進行腹腔鏡子宮角輸精；采用相同輸精密度、不同輸精時間（撤栓后48、54、60 h）分別對發情母羊進行腹腔鏡子宮角授精，通過沖胚進行卵子受精率和可用胚胎率檢查，探究對湖羊進行腹腔鏡子宮角輸精時的最適輸精密度與最適輸精時間。結果表明，輸精密度為2×10個/mL組的卵子受精率和可用胚胎率顯著低于其余4組（P<0.05），其余4組差異不顯著（P>0.05）；撤栓后48 h輸精組與撤栓后54 h輸精組可用胚胎率差異不顯著（P>0.05），但均高于撤栓后60 h，且差異顯著（P<0.05）；不同輸精密度的鮮精以及不同輸精時間均會對湖羊卵子受精率和可用胚胎率產生一定的影響，輸精密度為3×10個/mL可以作為湖羊鮮精輸精的最低有效密度，撤栓后48～54 h輸精可以作為湖羊腹腔鏡子宮角輸精的最佳時間。

關鍵詞輸精密度；輸精時間；沖胚；胚胎質量；綿羊

中圖分類號S826文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.022開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Different Experimental Conditions on Embryo Flushing Effect of Sheep

GAO Feng，LI Xin-hai（Xuzhou Institute of Biotechnology，Xuzhou，Jiangsu 221000）

Key wordsHu Sheep is one of the common sheep breeds in Jiangsu and Zhejiang regions， with excellent reproductive performance， fresh and tender meat and rich nutrition. In order to further explore the reproductive potential of Hu sheep， CIDR+PMSG+PG+FSH method was used to conduct simultaneous estrus and superovulation of Hu sheep， and on this basis， laparoscopic uterine horn insemination was performed on the estrous ewes; Laparoscopic uterine horn insemination was performed on estrous ewes using the same insemination density and different insemination times （48， 54， and 60 hours after thrombolysis removal）. The fertilization rate and available embryo rate were examined by embryo flushing to explore the optimal infusion precision and time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep. The results showed that the fertilization rate and available embryo rate of the 2×10 pieces/mL group were significantly lower than those of the other 4 groups （P<0.05）， while the other 4 groups had no significant difference （P>0.05）;There was no significant difference in the available embryo rate between the 48 h after thrombectomy and the 54 h after thrombectomy groups （P>0.05）， but both were higher than those at 60 h after thrombectomy， and the difference was significant （P<0.05）;fresh semen with different precision and different insemination time have certain influence on fertilization rate and available embryo rate of Hu sheep eggs， 3×10 pieces/mL could be used as the lowest effective density of fresh semen insemination in Hu sheep. 48-54 hours after embolectomy could be the best time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep.

Key wordsInfusion precision；Insemination time；Flushing embryo；Embryo quality;Sheep

湖羊是江浙地區常見的綿羊品種之一，繁殖性能優越，肉質鮮嫩，營養豐富，具有早熟、一年四季均可發情、多羔、泌乳性能優良、生長發育速度快、耐熱耐濕等優良性狀，是一種適宜廣泛舍飼的優良品種［1-5］。近年來，隨著腹腔鏡子宮角輸精技術的成熟和發展，優良種畜的利用率越來越受到重視。在技術水平相同條件下，提高種公羊的精液利用率，顯得尤為重要。為了進一步利用新技術開發湖羊繁殖優勢，該研究探究對湖羊進行腹腔鏡子宮角輸精時的最適輸精密度與最適輸精時間，以期為后續湖羊繁殖技術改良提供基礎參考，加快湖羊繁殖新技術的推廣。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物。試驗母羊選擇1～2歲齡，體重50 kg 左右，膘情良好，無生殖道疾病，未懷孕的經產湖羊母羊80只。試驗公羊選擇體格健壯，性欲旺盛，體重60 kg左右，無生殖道疾病的湖羊公羊10只。母羊與公羊分開飼養。

1.1.2藥品與儀器。羊用陰道栓（CIDR，南非ZOETIS公司生產），規格：每包20支，每支含0.3 g孕酮；獸用孕馬血清（PMSG，寧波三生生物科技有限公司生產），規格：1 000 IU/瓶，批號：110914564；氯前列烯醇（PGF2α，寧波三生生物科技有限公司生產），規格：每支2 mL每支含量0.2 mg，批號：110912207；促卵泡素（FSH，寧波第二激素廠）規格：100 IU/瓶，批號110254629，4 ℃條件保存。

試驗儀器包括沖胚管、母羊保定臺、恒溫水浴鍋、腹腔鏡、體視顯微鏡、子宮鉗、集精杯、手術剪、醫用噴壺、止血鉗、注射器、培養皿、手術刀片、醫用縫合線、留置針等。

1.2試驗方法

1.2.1飼養管理。精料選擇全價顆粒料，粗料選擇苜蓿、花生秧、秸稈等青貯飼料。每日上、下午各飼喂1次，置自動飲水器飲水。種公羊采精鮮精，活力在0.7以上才可使用。

1.2.2試驗動物分組與給藥。試驗時間：2021年10—11月，試驗地點：徐州湖羊養殖基地。

試驗發情母羊共80只，均進行同期發情和超數排卵處理，處理過程中不分組。

1.2.3同期發情與超數排卵處理。對所有母羊采用CIDR+PMSG+PG+FSH法進行同期發情和超數排卵處理。埋栓當天記為第1天，每只母羊都埋栓13 d，第11天下午開始肌注FSH，每隔12 h注射1次，連續注射7次，劑量逐漸遞減，FSH總劑量為400 IU/只。

1.2.4不同輸精密度沖胚效果試驗過程。將經過同期發情和超數排卵處理的發情母羊隨機分為5組，組別分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，每組10只，撤栓后48 h進行腹腔鏡子宮角授精。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別使用不同精液密度的鮮精，依次為2×10、3×10、4×10、5×10、6×10個/mL；每只母羊輸入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.5不同輸精時間沖胚效果試驗過程。將經過同期發情和超排處理的發情母羊隨機分為3組，每組10只，采用相同輸精密度、不同輸精時間進行腹腔鏡子宮角授精。根據輸精時間分組如下：Ⅰ組（撤栓后48 h）、Ⅱ組（撤栓后54 h）、Ⅲ組（撤栓后60 h）；每只母羊輸入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.6腹腔鏡子宮角輸精。穿刺部位一般選擇在母羊乳頭下方14 cm左右，腹中線兩側各穿刺1孔，見圖1乳頭下方黑點所在位置［6-7］。在左側乳頭下方14 cm左右，偏離腹中線左側3～4 cm 處插入0.7 cm的套管針，刺穿皮膚深度2 cm，將套管送入腹腔。通過套管往腹腔伸入帶有冷光源的內窺鏡，觀察卵巢上排卵點和紅體狀態以及數量。此時，在右側相同位置處插入套管針，拔針后通過套管插入輸精槍。用輸精槍輕輕挑起卵巢，以便觀察排卵點和紅體。如果卵巢上有多個紅體和排卵點時即可輸精，若沒有排卵點和紅體則不必輸精。找到子宮角分叉處，在一側子宮角距離分叉1/3 處，輸精槍前端針頭刺入子宮角內，應感覺到有阻力，緩慢注射1/2精液量，然后拔出針頭，將剩余精液注入另一側子宮角相應位置，完成輸精。

1.2.7胚胎的采集。輸精后第6天對供體湖羊采卵。手術前對供體湖羊肌肉注射陸眠寧1 mL/只。在靠近乳房的腹部作一縱行切口，用食指和中指夾住子宮角并拉出腹腔外，生理鹽水沖洗，用滅菌的回形針刺破子宮角壁，并從此處插入套管針，將針芯抽出，再用回形針刺破子宮角另一端，并在此處插入沖胚管。用注射器向沖胚管內注入適量水，能夠將子宮角撐開，但不能將子宮角壁撐破，在沖胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理鹽水從套管處注入沖胚，在沖胚管的末端收集沖胚液，然后用注射器將水囊的水抽完，從子宮角抽出沖胚管，沖洗子宮并放回腹腔，縫合腹壁，手術完成后肌肉注射陸醒寧1 mL/只，并肌肉注射青鏈霉素以防發生感染。

1.2.8檢胚。將沖胚液靜置10 min，在室溫下用體視顯微鏡放大20倍檢胚。先用吸管吸取上清液并棄掉，再用吸管將胚胎轉移至另一培養皿中，反復尋找胚胎，將所有胚胎檢出。

胚胎質量鑒別依據：胚胎按發育狀況和形態可依次分為A、B、C、D 4 個等級。A級，胚胎和胚齡發育階段吻合、結構緊湊、輪廓清晰、內細胞團完整均勻、透明帶光滑均勻、存在極少游離細胞，變性細胞比例少于10%；B級，基本符合胚胎胚齡發育一致、輪廓清晰、內細胞團較完整、透明帶較均勻、變性細胞為10%～30%；C級，胚胎與胚胎發育階段胚齡有差異，色澤與透明度較暗，變性和游離細胞占30～40%；D級，發育停滯、退化或萎縮的胚胎。其中，A級和B級胚胎為可移植胚胎，其妊娠率明顯高于C、D 級胚胎。仔細嚴格檢查收集到的胚胎，并且做好胚胎的質量鑒定分級和記錄。把同級的胚胎用吸管檢出放入內有胚胎保存液的培養皿，在蓋上做好標記備用。

1.3數據處理沖胚數包括未受精卵和受精卵形成受精胚胎的總數。受精率=受精胚胎數/沖胚數×100%，可用胚胎率=可用胚胎/受精胚胎數×100%。

用Excel 2003軟件記錄試驗數據并進行整理，用SAS軟件中的PROCFREQ程序進行差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1不同密度鮮精液對供體母羊沖胚的影響由表1可知，不同密度鮮精液對供體母羊腹腔鏡子宮角輸精后的沖胚結果有一定影響。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組鮮精沖胚數最高為137枚、最低為127枚；受精胚胎數最高為128枚、最低為110枚；卵子受精率最高為93.43%、最低為85.27%。受精胚胎中的可用胚胎數最高為111枚，最低為83枚；可用胚胎率最高為86.72%，最低為75.45%。Ⅰ組（2×108個/mL）與其余各組相比，無論在卵子受精率和可用胚胎率上均存在顯著差異（P<0.05），其余各組不存在顯著差異（P>0.05）。

2.2不同輸精時間對供體母羊沖胚的影響由表2可知，不同輸精時間對供體母羊腹腔鏡子宮角輸精后的沖胚結果有一定影響。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組沖胚數最高為146枚、最低為132枚；受精胚胎數最高為139枚、最低為118枚；卵子受精率最高為95.21%、最低為84.29%。受精胚胎中的可用胚胎數最高為122枚、最低為93枚；可用胚胎率最高為87.77%、最低為78.81%。Ⅲ組（60 h）與其余各組相比，無論在卵子受精率和可用胚胎率上均存在顯著差異（P<0.05），其余各組不存在顯著差異（P>0.05）。

3討論

隨著腹腔鏡子宮角輸精技術的成熟和發展，優良種畜的利用率越來越受到重視。在技術水平相同條件下，提高種公羊的精液利用率顯得尤為重要。

3.1不同輸精密度對綿羊胚胎移植供沖胚的影響試驗結果表明，在進行湖羊腹腔鏡子宮角輸精時可以將精液密度稀釋7～10倍，達到3×10個/mL，每只母羊輸入0.2 mL，有效精子數0.42億～0.54億，其卵子受精率可達91.67%，可用胚胎率達85.95%。一般來講，綿羊的精液密度為20億～30億/mL，每次采精1.5 mL左右。傳統的子宮頸輸精和陰道人工授精普遍采用3～4倍稀釋后，每只母羊輸入0.2 mL的精液，這在一定程度上造成了優質精液的浪費，加上傳統輸精效果有限，就限制了優質精液的利用。劉桂娟等［8］在綿羊人工授精和腹腔鏡輸精效果比較研究中發現腹腔鏡輸精受胎率為89.9%，遠高于人工授精組的39.2%。蘇和等［9］在對美利奴羊、無角陶賽特羊的腹腔鏡輸精試驗中發現腹腔鏡輸精受精率92.71%，遠高于人工授精組的受精率79.33%，并且腹腔鏡輸精有效精子數0.3億時，沖胚受精率可達90.83%。毛鳳顯等［10］在腹腔鏡輸精對白山羊研究中，采用鮮精有效精子數0.5億輸精，其母羊受精率達到85.71%。魏玉剛［11］將精液稀釋5倍采用腹腔鏡子宮角輸精對卡拉庫爾羊進行試驗，其受胎率達到89.8%，遠高于人工授精組的受胎率70.9%。許文海［12］在對薩福克綿羊進行腹腔鏡輸精技術研究中也發現，輸精密度為3×10個/mL時，其可用胚胎率可達88.2%。從以上研究結果來看，將公羊鮮精進行多倍稀釋后，受胎率仍可以達到85%以上，其研究結果與該次試驗結果基本一致。由此可見，傳統的子宮頸輸精和陰道輸精雖然操作方法較為簡單，但是由于很多客觀原因，如陰道和子宮頸彎曲程度和皺褶程度高，精子難以穿過，還容易出現倒流的現象，所以造成傳統輸精方法受胎率低。相比傳統輸精方法，腹腔鏡輸精操作雖然有一定難度，但是經過訓練后短時間可以掌握，加之對母羊傷害并不大、受胎率遠高于傳統輸精方法，應該得到大力推廣。另外，從試驗結果來看，在腹腔鏡輸精背景下，一定程度上對精液進行高倍稀釋，卵子受精率和可用胚胎率都會相應提高，可以節省精液，提高優質公畜精液的利用率。但是，該次試驗僅涉及鮮精的使用，對于不同密度冷凍精液對腹腔鏡子宮角輸精的效果還有待研究。

3.2不同輸精時間對綿羊胚胎移植供體沖胚效果的影響分析該次研究結果可知，撤栓后48和54 h的腹腔鏡輸精在卵子受精率和可用胚胎率上差異不顯著，但是要高于撤栓后60 h，且差異顯著。高志英等［13］在對多浪羊的研究中發現，撤栓后48 h采用凍精進行陰道輸精，受胎率達到24.52%。肖西山［14］在對小尾寒羊的研究中發現，撤栓后48～60 h采用鮮精連續陰道輸精2次，受胎率達到68.33%。韓旭飛等［15］在對東北細毛羊的研究中發現，撤栓48 h后，腹腔鏡輸精受胎率達到89.9%。王晶晶［16］在對美利奴羊的研究中發現，撤栓后48 h腹腔鏡輸精受胎率達到90%，要遠高于撤栓后24、36和72 h。趙霞等［17］在對綿羊腹腔鏡輸精研究中發現，撤栓后46～58 h獲得的受胎率在89.92%～97.44%，遠高于其他時間段的受胎率。張靜等［18］在對烏珠穆沁羊腹腔鏡輸精研究中發現，最佳輸精時間應在撤栓后48～58 h，受胎率在92.4%～94.8%。綜上可知，無論是陰道和子宮頸輸精還是腹腔鏡輸精，輸精時間均為36～58 h，與該次試驗結果基本一致。綿羊排卵基本發生在發情結束前后，精子維持受精時間在3 d左右，卵子維持受精的時間較短，在5 h左右，而綿羊同期發情大致在撤栓以后的48 h左右。相比傳統輸精方式，腹腔鏡輸精節省優質精液的使用量和精子的運行時間。從該試驗結果來看，在撤栓后48～54 h輸精可以使可用胚胎率達到87.77%，有效地保證輸精效果。但是，該試驗僅涉及鮮精的使用，對于不同時間段冷凍精液對腹腔鏡子宮角輸精的效果還有待研究。

4結論

近年來，羊的腹腔鏡輸精技術得到了飛速的發展，而精液品質的好壞，是此項技術能否成功推廣的關鍵。最佳輸精密度和輸精時間是推廣腹腔鏡輸精技術、擴大優質公畜利用率關鍵技術之一。輸精密度低，會導致卵子受精率下降；精液密度過高，不僅會浪費優質種質資源，也會造成惡化精子生存環境，降低精液品質。輸精時間過早母羊未及時排卵，卵子不夠成熟；輸精時間過晚卵子會出現退化，同樣難以完成受精作用。該研究通過分析不同輸精密度和輸精時間對鮮精腹腔鏡子宮角輸精效果，認為：在腹腔鏡子宮角輸精技術背景下，湖羊的輸精最低輸精密度可以設置為3×108個/mL，高于此密度卵子受精率和可用胚胎率并沒有大幅度提高，低于此密度會造成下降；最佳輸精時間宜在撤栓后48～54 h。通過最低輸精密度和最佳輸精時間的設置，可以大大提高優秀種公羊的利用率和覆蓋面，降低種公羊的飼養規模，從人力、物力等多方面節約成本，給羊場帶來更大的經濟效益。

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