紫玉蘭葉總黃酮的提取工藝優化及對亞硝酸鹽清除能力研究

陳健旋, 蘇羽璇, 莊遠紅, 陳建福,3*

(1. 漳州職業技術學院 食品工程學院;2.閩南師范大學 生物科學與技術學院;3.福建省精細化工應用技術協同創新中心:福建 漳州 363000)

紫玉蘭(MagnolialiliifloraDesr.)又名辛夷,為木蘭科木本植物,其存于我國的栽培歷史時間已達2千多年[1-2]。紫玉蘭中含有多酚、黃酮、精油等許多具有抗微生物、抗炎、抗血小板、抗過敏作用的天然有效成分,正因這些獨特的成分,紫玉蘭常被用來治療流鼻涕、頭痛、鼻塞、風寒等癥狀[3],其中,黃酮是存在于植物體中具有2-苯基色原酮結構的化合物,具有抗炎、抑制細菌、降低人體血壓、抗擊外輻射、抗擊癌癥、增強人體免疫力等諸多作用,而且還具有防治人體心腦血管系統疾病和人體呼吸系統疾病的作用[4-5]。

超聲波提取法是一種在超聲波的機械效應、空化效應和熱效應的共同作用下,促進并提高植物細胞壁的通透性,加速細胞吸水膨脹,強化細胞內容物與提取溶劑間的傳質速率,加速細胞中活性成分溶出的一種新型提取方法[6-7]。響應面法是常用的工藝優化方法,是在實驗數據的基礎上,結合軟件分析,采用多元二次回歸方程來分析自變量對響應變量的影響,并以圖形形式表達出擬合因素與響應值之間函數關系,可直觀地呈現出各因素之間的交互性,從而實現實驗參數預測的可靠性與準確度[8-9]。亞硝酸鹽是一種可以保持食物的顏色和光澤的食品添加劑。適量的亞硝酸鹽可以延長食物的儲存時間,但過量的亞硝酸鹽促進蛋白羰基和二硫鍵的形成,導致人體缺氧、頭暈、昏迷甚至喪失生命。亞硝酸鹽的清除主要依靠酸解、酶解和還原劑還原等[10]。研究表明,一些天然植物中的提取物可以與亞硝酸鹽發生反應,從而消除或降低食物中的亞硝酸鹽含量[11]。當前,對于紫玉蘭的研究主要集中在栽培、觀賞和組織培養上,對紫玉蘭有效成分的提取研究較少。該研究以紫玉蘭葉為原料,利用響應面法對紫玉蘭葉總黃酮超聲波輔助提取工藝進行優化并評價其對亞硝酸鹽的清除能力,為紫玉蘭資源開發成為亞硝酸鹽清除劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

紫玉蘭葉,采摘于漳州市馬鞍山,清洗過后置于烘箱烘干,粉碎后封裝置于陰涼干燥處,備用;乙醇為食品醫藥級;其余試劑均為市售分析純。

分光光度計(UV-200),上海美普達儀器有限公司;超聲波清洗器(KQ-100TDE),昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁為標準品測定總黃酮。以70%乙醇為溶劑,于100 mL容量瓶中溶解0.100 0 g蘆丁標準品,定容后配成1.0 g/L的標準液。取5 mL標準液加入到50 mL容量瓶中,搖勻定容,配制出濃度為0.1 g/L 的蘆丁母液。再分別從中取0.5、1、1.5、2、2.5和3 mL的蘆丁母液到5支試管中,然后依次加入70%的乙醇直到5.0 mL,這時溶液的濃度是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 g/L。繼續加入0.3 mL 5%的NaNO3,搖勻后靜置5 min,然后再加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3,搖勻靜置6 min,繼續加入2 mL 4%的NaOH,搖勻后繼續添加70%乙醇直到10 mL,最后靜置15 min。此時溶液的濃度為0.005、0.01、0.015、0.02、0.025和0.03 g/L。在紫外分光光度計的吸光度位于510 nm時,用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[12]進行比色。在510 nm下測其吸光值(A)。以OD510為縱坐標,對照品的濃度(g/L)為橫坐標。通過線性擬合得到回歸方程:y=10.451x+0.000 3,R2=0.999 4。

1.2.2 總黃酮提取率的測定

在100 mL圓底燒瓶中加入事先準備好的紫玉蘭葉粉末1.00 g,再加入乙醇,超聲波清洗器提前設好溫度和時間,等到水溫到達設定的溫度后,開始提取。超聲結束后,將圓底燒瓶取下,放入大燒杯中靜置冷卻,冷卻后將提取液濃縮定容后再進行稀釋,根據1.2.1的方法,測定其吸光值,計算總黃酮的提取率,具體計算公式如下:

式中,C為總黃酮的質量濃度(mg/L),V為稀釋后的提取液體積(L),m為紫玉蘭葉質量(g)。

1.2.3 單因素試驗設計

固定基礎工藝條件為超聲溫度65 ℃、液料比35 (mL∶g)、乙醇濃度60%和超聲時間30 min,分別考察超聲溫度為55、60、65、70和75 ℃、液料比為25、30、35、40和45 (mL∶g)、乙醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%和超聲時間為10、20、30、40和50 min的條件下,獲得的提取液,并按1.2.2的方法計算出提取率,以確定最佳的工藝條件。

1.2.4 響應面試驗

根據所考察的單因素試驗確定出各工藝條件對紫玉蘭葉總黃酮提取率的最佳取值范圍,然后在最佳取值范圍內,進行Box-Benhnken試驗設計和響應面優化,因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面因素及水平Table1 Factors and Levels of Box-Behnken response surface

1.3 紫玉蘭總黃酮亞硝酸鹽的清除能力

在比色管中分別加入10.0 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值3.0)、1.0 mL NaNO2溶液(50 g/mL)和5 mL不同濃度的紫玉蘭葉總黃酮溶液,設置水浴鍋37 ℃保溫1 h后分別加入2.0 mL對氨基苯磺酸(0.4%)和1.0 mL的鹽酸萘乙二胺(0.2%),定容至25 mL,靜置15 min,在540 nm處測得吸光度A,紫玉蘭葉總黃酮溶液濃度為0時的吸光度為A0,并以Vc為對照,分別計算亞硝酸鹽的清除率[13]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

超聲溫度55～75 ℃中,65 ℃時的紫玉蘭葉總黃酮提取率達到最大值(圖1)。這是因為溶劑分子熱運動與溫度有關,超聲溫度較低時,分子熱運動較小,葉片細胞壁兩側的滲透與擴散能力較小,導致總黃酮提取率低;而過高的超聲溫度會導致總黃酮中化學結構較不穩定的分子發生氧化[14-15]。因此,超聲溫度選擇為65 ℃。

圖1 超聲溫度對黃酮提取率的影響

2.1.2 液料比對總黃酮提取率的影響

液料比25～45 (mL∶g)中,35 (mL∶g)時的紫玉蘭葉總黃酮提取率達到最大值(圖2),這是因為總黃酮的溶出與提取溶劑的用量有關,溶劑與原料2個體系中的總黃酮之間存在一定的濃度差,產生溶出傳質推動力,使得原料中的總黃酮向溶劑中擴散,液料比較小時,溶劑用量較少,溶劑中總黃酮含量與原料中總黃酮含量較快達到平衡,而溶劑用量較高時,推動力較大,可使更多的總黃酮溶出[16]。當溶劑用量過大時,在后續的濃縮等操作單元中,會增加總黃酮的損失,導致總黃酮提取率的下降。因此,液料比選擇為35 (mL∶g)。

圖2 液料比對黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

乙醇濃度40%～80%中,60%時的紫玉蘭葉總黃酮提取率達到最大值(圖3),這是因為提取溶劑的極性是由乙醇的濃度決定的,乙醇濃度較低時則溶劑中水含量較高,極性較大,與總黃酮的極性區別較大,總黃酮溶出率較低,而乙醇濃度較高時又會增加細胞內容物中脂溶性物質溶出與總黃酮競爭,溶劑被爭奪[17]。因此,乙醇濃度選擇為60%。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲時間對黃酮提取率的影響

超聲時間10～50 min中,30 min時的紫玉蘭葉總黃酮提取率達到最大值(圖4),這是因為總黃酮從細胞壁滲透溶出需要一定的時間,當超聲時間較短時,總黃酮還未完全溶出,提取率較小,而超聲時間較長時,總黃酮在較長的超聲時間內發生氧化而結構受損[18]。因此,超聲時間選擇為30 min。

圖4 超聲時間對黃酮提取率的影響

2.2 響應面試驗的結果分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據2.1單因素試驗的結果,設計4因素3水平的Box-Behnken試驗,組成29個試驗點進行(表2)。分析數據得到表3中各個自變量的交互作用對黃酮提取率的影響。

表2 響應面分析方案及結果

擬合表3的數據,可以得出紫玉蘭葉中總黃酮提取率(Y)的回歸模型為:Y=95.57-1.55A+0.78B+1.52C+0.50D+0.76AB+1.43AC+0.39AD-0.44BC-1.78BD- 1.52CD-3.83A2-1.31B2-2.34C2-3.25D2。

分析表3可知,模型的P<0.01,這說明該模型達到了極顯著水平。回歸系數R2=0.915 2,失擬度為0.147 4>0.05,表明擬合度好,并且響應值的改變有91.52%的可能與自變量的改變有關。根據F值大小可以推斷出各因素對提取率的影響程度為:超聲溫度、乙醇濃度、液料比、超聲時間。其中,一次項A、C和二次項A2、C2、D2的P值都小于0.01,說明所考察的這些項對紫玉蘭葉總黃酮的提取率都有著極顯著的影響,并且說明所考察的工藝條件對響應值的影響不是簡單的線性關系。在以上綜合分析的基礎上可以看出,利用該二次回歸方程模型對紫玉蘭葉總黃酮的提取工藝進行分析與預測是可靠的。

表3 方差分析結果

2.2.2 因素間交互作用對黃酮提取率的影響

最優參數以及各參數之間的影響能通過響應面圖表示出來。根據回歸分析的結果,將任一因素看作是零水平,就可以得到其他2個因素交互作用的結果,并據此做出回歸方程的響應面圖形。響應面圖的曲面越陡,等高線圖的等密度線越密集,那么兩因素交互作用的影響就越顯著。等高線圖可以直接體現出兩因素交互作用的顯著程度,如果兩因素具有顯著的交互作用,等高線即為橢圓,反之則為圓形。

由圖5中可以看出,坡度最大的是液料比和超聲時間這兩者的響應面曲面,并且其等高線也最密,說明其交互作用對響應值的影響最為顯著,陡峭程度和等高線密度排在第2的是乙醇濃度和超聲時間。說明乙醇濃度和超聲時間對響應值的影響顯著性程度次之,用同樣的方法分析可知,各自變量間交互作用對響應值影響程度的順序為BD,CD,AC,AB,BC,AD。

2.2.3 最佳工藝條件的確定

通過對試驗數據的分析可以得出,用超聲波輔助法提取紫玉蘭葉中黃酮類化合物的最優參數分別是超聲溫度64.36 ℃、液料比36.30 mL/g、乙醇濃度62.83%和超聲時間29.32 min,此時的理論提取率為95.97 mg/g。為了便于操作,將條件修正為:超聲溫度64 ℃、液料比36 mL/g、乙醇濃度63%和超聲時間29 min。在修正后的試驗條件下做3組驗證試驗,得出提取率為95.72 mg/g。與預測值較為接近(相對誤差0.26%),說明方程擬合度良好。響應面法可以優化紫玉蘭葉黃酮的提取工藝。

圖5 各工藝因素交互作用對提取率的影響

2.3 紫玉蘭葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力

由圖6可知,在所考察的濃度范圍(1.0～6.0 mg/L),紫玉蘭葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除率隨著紫玉蘭葉總黃酮濃度的增加而增大,當紫玉蘭葉總黃酮濃度為3.0 mg/L時,對亞硝酸鹽清除率已超過了50%,通過計算得到其對亞硝酸鹽清除率的IC50為2.58 mg/L。當紫玉蘭葉總黃酮為6.0 mg/L時,清除率已達到74.21%,表明紫玉蘭葉總黃酮與亞硝酸鹽清除率之間存在量效關系,紫玉蘭葉總黃酮具有良好的亞硝酸鹽清除率,但小于維生素C的清除率。

圖6 維生C和紫玉蘭葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除率

3 結論

該試驗運用單因素試驗和響應面法優化了紫玉蘭葉總黃酮的提取工藝,通過Design expert 7.05b軟件構建超聲波輔助法提取紫玉蘭葉總黃酮的數學回歸模型。以該模型的回歸方程及其等高線圖為依據,研究4個因素及4個因素相互之間的作用對提取率的影響大小,結果為超聲溫度>乙醇濃度>液料比>超聲時間。確定了最佳的工藝條件為:超聲溫度64 ℃、液料比36 (mL∶g)、乙醇濃度63%和超聲時間29 min,此時的總黃酮提取率為95.72 mg/g。與預測值的誤差僅有0.26%,說明該模型合理,預測可靠。紫玉蘭葉具有良好的亞硝酸鹽清除率,其與亞硝酸鹽清除率之間存在量效關系,當紫玉蘭葉總黃酮濃度為3.0 mg/L時,對亞硝酸鹽的清除率已超過了50%,其IC50為2.58 mg/L;當紫玉蘭葉總黃酮為6.0 mg/L時,清除率已達到74.21%,但小于維生素C的清除率,該研究能為紫玉蘭葉黃酮類化合物的提取提供參考和理論依據。