姜酮對急性心肌梗死大鼠心肌的保護作用及機制研究

張帆,劉江文,唐艷紅,黃從新

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是全球心血管疾病中致死率最高的疾病之一,主要是由于冠狀動脈閉塞或冠狀靜脈痙攣導致心肌細胞急性缺血缺氧,從而導致心肌細胞壞死[1]。一般將心肌梗死分為3個階段:炎性反應期、修復期及重塑期[2]。在炎性反應期,過強的炎性反應會波及殘存的心肌細胞進一步加劇心肌組織的壞死[3]。Marinkovic等[4]通過S100A9抑制心肌梗死早期炎性反應可明顯逆轉心功能的衰竭。因此,早期采取抗炎措施能減少心肌組織的丟失,加快心臟的修復及重塑,緩解心肌梗死后心力衰竭的發生[5]。姜除了作為常見的天然香料以外,還可用于治療多種疾病。姜的藥理活性主要歸功于姜中的生物活性成分——姜酮,其具有抗氧化、抗炎及抗菌等多種藥理學特性[6]。Hsiang 等[7]通過活體小鼠發光證實姜酮可顯著抑制脂多糖誘導的核因子κB(NF-κB)上調來發揮抗炎作用。除此之外,Ahmad等[8]發現姜酮通過增加還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性實現對氧化應激的抑制。但姜酮在心血管領域藥用作用研究較少,本文就姜酮在急性心肌梗死大鼠模型中的作用及機制展開研究,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:雄性SPF級SD大鼠,體質量(180±20)g,由武漢大學實驗動物中心提供。飼養溫度為22℃～25℃,適應性飼養1周后開始實驗。試劑:姜酮(ZGR)購自上海融禾醫藥科技發展有限公司;白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;SOD、丙二醛(MDA)試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司;核轉錄因子紅系2相關因子(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、NF-κB一抗購自美國Cell Signaling公司。儀器設備:VINNO V6小動物超聲儀購自飛依諾科技股份有限公司;凝膠成像系統購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 實驗方法 2022年7—9月于武漢大學人民醫院心血管病研究所進行實驗。將30只大鼠通過隨機數字表法分為Sham組、心肌梗死(MI)組、MI+ZGR組,每組10只。MI+ZGR組給予ZGR(6 mg·kg-1·d-1)[9]灌胃預處理14 d后造模,其余2組等量生理鹽水灌胃。MI組、MI+ZGR組模型制備:于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)麻醉,備皮后將大鼠仰臥固定于手術臺,連接小動物呼吸機輔助呼吸(70次/min)。予以碘伏消毒后于大鼠胸骨左緣1 cm處剪開皮膚,分離肌肉,于第3、4 肋間鈍性開胸,充分暴露心臟后,在左心耳下緣約2 mm處用6-0眼科帶線縫合針結扎左冠狀動脈前降支,心尖部變白提示AMI造模成功。隨后擠出胸腔空氣,依次縫合肋間、肌肉和皮膚。待大鼠恢復自主呼吸后撤除呼吸機。Sham組施行相同的操作步驟但不結扎動脈。ZGR組術后繼續給藥1周,Sham組、MI組給予等量生理鹽水處理。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 超聲心動圖檢查:造模成功的第7天,使用小動物超聲儀將探頭置于大鼠左心室乳頭肌平面檢測大鼠心臟結構和功能。測量指標:左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室短軸縮短率(LVFS)和左心室射血分數(LVEF)。其測量結果取5個心動周期中的平均測量值。

1.3.2 組織病理學檢查:于大鼠腹腔內注射3%戊巴比妥鈉,麻醉完成后固定于手術臺后開胸。使用真空采血管于腹主動脈取血1 ml,迅速剪取心臟并分離保存于4%多聚甲醛中固定。進行包埋、切片、脫蠟、脫水、沖洗,使用蘇木素—伊紅(HE)染色。通過顯微鏡觀察組織的病理變化。

1.3.3 ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA水平:將此前采集的血樣于室溫存放60 min,使用離心機離心獲取血清。取大鼠心肌組織,使用研磨儀研磨成勻漿。按照試劑盒說明書操作流程分別檢測血清炎性因子IL-6、TNF-α表達水平及心肌SOD、MDA水平。

1.3.4 Western-blot檢測大鼠心肌組織HO-1、Nrf2、NF-κB蛋白的表達水平:取大鼠心肌梗死周邊組織,加RIPA裂解液,置于研磨儀中裂解。離心后取上清提取總蛋白,使用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量。隨后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,電泳結束后對蛋白進行轉膜、封閉。與Nrf2、HO-1、NF-κB一抗在4℃下孵育過夜,再與二抗孵育1 h。孵育完成后通過ECL試劑進行顯影,使用掃描儀進行條帶掃描,Image J軟件用于條帶的分析。

2 結 果

2.1 3組大鼠超聲心動圖結果比較 心臟超聲檢查結果顯示,與Sham組比較,MI組大鼠的LVEDD、LVESD均顯著增大(P<0.01),LVEF、LVFS顯著降低(P<0.01)。而與MI組比較,MI+ZGR組大鼠的LVEDD、LVESD降低(P<0.05或P<0.01),LVEF、LVFS升高(P<0.05),見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織病理改變比較 病理學結果顯示,Sham組大鼠心肌細胞形態規則,結構正常,未見炎性細胞浸潤。而MI組大鼠視野可見明顯炎性細胞浸潤,間質水腫及心肌細胞壞死。與MI組比較,ZGR處理可以顯著減輕AMI大鼠炎性細胞的浸潤,改善細胞腫脹程度,見圖1。

2.3 ZGR對AMI大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA的影響 與Sham組比較,MI組大鼠血清IL-6、TNF-α顯著上調(P<0.01),心肌組織中的SOD顯著下降(P<0.01),MDA顯著上升(P<0.01)。與MI組比較,MI+ZGR組大鼠血清IL-6、TNF-α顯著降低(P<0.01),心肌組織SOD顯著上調(P<0.01),MDA顯著下降(P<0.01),見表2。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標比較

圖1 ZGR對AMI大鼠心肌組織病理變化的影響(HE染色,×200)

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA表達比較

注:與Sham組比較,aP<0.01;與MI組比較,bP<0.01。

2.4 ZGR對AMI大鼠心肌組織Nrf2、HO-1及NF-κB蛋白表達的影響 與Sham組比較,MI組大鼠的心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低,NF-κB蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與MI組比較,MI+ZGR組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著上調,NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.01),見圖2。

3 討 論

心肌梗死誘發的心臟損傷可導致無菌性炎性反應,成纖維細胞首先受到缺血和缺氧的影響,其通過上調TLR-NF-κB途徑促進pro-IL-1β的轉錄及翻譯[10],激活NLRP3炎性小體后切割pro-IL-1β活化IL-1β,最終釋放IL-1β[11]。IL-1β在心肌梗死的炎性反應中發揮關鍵作用,其可誘導最初的促炎反應和細胞因子/趨化因子的釋放,并招募和激活炎性細胞[12]。

在心肌線粒體和內質網的能量代謝過程中會產生活性氧(reactive oxygen species, ROS),通常情況下活性氧的產生與清除處于動態平衡之中[13]。在生理狀態下,其對調節心臟發育、收縮及能量代謝均有著重要意義[14]。然而在缺血、缺氧等病理狀態下,活性氧水平異常升高會使心肌進入氧化應激狀態。大量活性氧的堆積會損傷DNA、蛋白質及脂質,同時引起線粒體的損傷,導致心肌功能異常及心肌細胞死亡。這一過程常見于心力衰竭及心肌缺血等病理狀態中。氧化應激同樣對IL-1β的激活起到了重要作用[15]。在心肌梗死發生之后,巨噬細胞中線粒體的活性氧積累顯著增加,導致促炎細胞因子IL-1β的大量表達[16]。而心肌梗死后炎性反應的加重、延長或擴大會導致心肌梗死后更嚴重的心肌重塑和功能障礙[17-18]。通過適當的抗炎治療可減少心肌纖維化并改善心臟重塑[19]。

姜酮是一種天然提取的生物活性物質,姜酮已被證實可激活AMPK/Nrf2/HO-1緩解哮喘中的炎性反應[6,20]。在肺纖維化中,姜酮也展現出強大的抗氧化應激及抗炎性反應作用[21]。Zhu等[22]的研究顯示,姜酮可以通過誘導活化Nrf2,使得中性粒細胞中的活性氧水平下降。既往研究表明,Nrf2的激活能顯著改善心肌梗死的炎性反應及氧化應激水平[23]。因此,認為姜酮可通過改變Nrf2、NF-κB發揮抗炎及抗氧化應激作用。在本次研究中,發現姜酮可顯著改善心功能,并且減少炎性細胞在心肌組織中的浸潤。通過檢測各組大鼠血清指標,姜酮可顯著減輕血清中炎性指標及心肌組織中氧化應激的水平,并上調抗氧化應激分子水平。

NF-κB是關鍵的細胞內信號分子,在心肌梗死的狀態下,存在眾多信號通路使其活化,從而驅動TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎基因的表達[24],同時通過內質網應激介導的機制誘導細胞凋亡。NF-κB的持續活化會加劇心臟重塑,而在缺血—再灌注期間抑制NF-κB的表達有助于減輕心肌炎性反應,減小梗死面積[25]。Nrf2是一種轉錄因子,它可以通過調節一系列抗氧化酶和抗炎因子的基因表達來減輕細胞損傷,如促進HO-1的表達。HO-1具有酶活性,可以降解血紅素并產生低濃度一氧化碳。少量的一氧化碳可以促進線粒體的合成[26]。通過人為誘導Nrf2的表達有助于在缺血條件下減少心肌梗死的面積,保護左心室功能及減少心律失常等不良事件的發生[27]。在本研究中,通過蛋白免疫印跡技術,發現姜酮能通過降低NF-κB水平、激活Nrf2/HO-1的表達來發揮抗炎、抗氧化應激作用。心臟超聲及心肌組織病理也證實,其可以改善心肌梗死大鼠的心臟功能狀態。

綜上所述,姜酮可通過抑制炎性反應及氧化應激反應來保護心肌梗死后的心功能,但是其作用的詳細機制及臨床應用需要進一步的研究去驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張帆:設計研究方案,實施研究過程,分析實驗數據,論文撰寫;劉江文:提出研究思路,資料搜集整理,論文修改;唐艷紅:論文審核;黃從新:課題設計,論文審核