胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平及其臨床意義

楊思雨,姜淮蕪,姚暉,周航宇,馬波

胃癌已成為全球消化道惡性腫瘤之一,其在我國具有較高發病率和病死率[1]。目前診斷胃癌的金標準是以胃鏡活檢為主,此方法費用高,耐受性差,因此未成為大規模篩查胃癌的方法[2]。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的變化,胃癌患者呈現出年輕化的趨勢,若不及時診治將嚴重威脅患者生命健康。近年來,胃癌的診治取得很大進展,但胃癌患者預后效果不佳,因此尋找能夠準確評估患者預后的生物標志物對于胃癌患者預后意義重大[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)屬于短鏈非編碼RNA分子,其與機體細胞分化、凋亡等多重生理功能相關,在不同的腫瘤疾病中有著不同的作用[4-5]。研究發現,miR-369-3p在甲狀腺濾泡癌組織和肝癌組織中均表達下調,上調其表達可抑制癌細胞的增殖、生長和轉移[6-7]。miR-1323與肺腺癌患者預后、肺炎支原體肺炎等肺部疾病相關[8-9]。本研究通過檢測胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達水平,分析二者與臨床病理特征的關系及對患者預后的預測價值,旨在為胃癌患者預后評估提供新的生物靶標,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月—2018年3月西南醫科大學附屬醫院胃腸外科手術治療的胃癌患者97例為病例組,男49例,女48例,年齡36～74(60.43±10.67)歲;體質量指數(BMI)20～25(22.36±1.97)kg/m2;另外選擇同期醫院健康體檢者90例作為健康對照組,男44例,女46例,年齡32～76(60.89±8.35)歲;BMI 20～25(22.54±1.56)kg/m2。2組性別、年齡、BMI比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準(1600139),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經病理學檢查確定為胃癌[10];②首次進行胃癌切除手術;③胃癌患者均采用常規標準胃癌根治術治療,術后根據患者病情進行輔助化療措施;④臨床資料完整。(2)排除標準:①合并其他惡性腫瘤者;②有嚴重心臟、肝臟、腎臟疾病者;③有嚴重免疫缺陷者;④臨床資料不全者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-369與miR-1323水平檢測:患者于入院后24 h內及健康對照組體檢當日清晨抽取空腹肘靜脈血5 ml,離心留取血清,置于-80℃冰箱中保存備用。使用TRIzol試劑(購自北京普非生物科技有限公司)提取胃癌患者血清中的總RNA,后進行反轉錄(M-MLV反轉錄試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司),取反轉錄產物進行qRT-PCR反應(qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司,型號 CFX384;熒光定量PCR試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司),qRT-PCR反應程序:94℃預變性5 min、95℃變性15 s、56℃退火30 s、62℃延伸30 s,共循環35次。分別以U6為內源對照,以2-ΔΔCt法計算miR-369與miR-1323表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成,miR-369上游引物:5’-CTCCTGGTACCTGAA-GGGAGA-3’,下游引物:5’-CTCCAAGGTGACTGA-GATTTGAT-3’;miR-1323上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCA-CA-3’,下游引物:5’-AACGCTTCGAATTTG-CGT-3’;U6上游引物:5’-ATTGGAACGATACAG-AGAAGATT-3’,下游引物:5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。

1.3.2 隨訪:采用到院復診或電話等方式對胃癌患者術后進行隨訪,隨訪時間為3年,隨訪率100%,根據患者隨訪期間生存或者死亡情況,分為預后良好亞組59例和預后不良亞組38例。

2 結 果

2.1 2組血清miR-369與miR-1323水平比較 病例組血清miR-369表達顯著低于健康對照組,血清miR-1323表達顯著高于健康對照組 (P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與病例組血清miR-369與miR-1323水平比較

2.2 不同預后亞組胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達比較 預后不良亞組患者血清miR-369表達顯著低于預后良好亞組,血清miR-1323表達顯著高于預后良好亞組(P<0.01),見表2。

表2 預后良好亞組與預后不良亞組胃癌患者血清miR-369與miR-1323表達水平比較

2.3 血清miR-369、miR-1323表達在胃癌患者不同臨床/病理特征中比較 血清miR-369、miR-1323表達在不同性別、年齡、基礎病、家族遺傳史、吸煙史、飲酒史等患者比較,差異無統計學意義(P>0.05),而在患者不同癌組織的分化程度、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度方面比較,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

2.4 血清miR-369與miR-1323預測胃癌患者預后的價值分析 繪制血清miR-369與miR-1323預測胃癌患者預后價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清miR-369、 miR-1323及二者聯合預測胃癌患者預后的AUC為0.704、0.747、0.823,二者聯合預測價值優于各自單獨預測(Z/P=2.713/0.006,1.733/0.040),見表4、圖1。

表3 血清miR-369與miR-1323表達在胃癌患者不同臨床/病理特征中比較

表4 血清miR-369與miR-1323預測胃癌患者預后價值分析

圖1 ROC曲線分析血清miR-369與miR-1323對胃癌患者預后的預測價值

2.5 血清miR-369、miR-1323水平與胃癌患者預后的關系 以胃癌患者miR-369、miR-1323表達均值0.75、1.27為界限,將患者分為miR-369高表達亞組63例、miR-369低表達亞組34例,miR-1323高表達亞組51例、miR-1323低表達亞組46例。采用Kaplan-Meier法分析胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平與患者預后的關系,結果顯示,miR-369低表達亞組患者3年累積生存率(35/63,55.56%)顯著低于miR-369高表達亞組患者(24/34,70.59%),差異有統計學意義(χ2=3.974,P=0.046);miR-1323高表達亞組患者3年累積生存率(21/51,41.18%)顯著低于miR-1323低表達亞組患者(38/46,82.61%),差異有統計學意義(χ2=22.315,P<0.001),見圖2。

2.6 多因素Cox回歸分析影響胃癌患者預后的因素 以胃癌患者預后為因變量(預后不良=1,預后良好=0),以miR-369(低表達=1,高表達=0),miR-1323(高表達=1,低表達=0),分化程度(低分化=1,高、中分化=0);TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期=1,Ⅰ+Ⅱ期=0),淋巴結轉移(有=1,無=0)、腫瘤直徑(≥5 cm=1,<5 cm=0),浸潤深度(T4=1,T1～T3=0)為自變量進行Cox回歸分析,結果顯示miR-369低、miR-1323高、分化程度低、TNM分期高、淋巴結轉移、浸潤深度高是胃癌患者預后不良的危險因素(P<0.05),見表5。

圖2 血清miR-369、miR-1323表達與胃癌患者預后的關系

表5 Cox回歸分析影響胃癌患者預后的因素

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,該疾病在患者早期不易察覺,到院就診時已是中晚期,治療比較困難,患者術后復發風險較高,對患者的預后構成嚴重威脅。根治性切除術是目前治療胃癌主要方法之一,但部分患者手術療效欠佳,患者術后復發轉移風險較高,5年生存率較低[11]。miRNA是近年來臨床腫瘤分子生物學研究的熱點,其作為腫瘤抑制因子或致癌基因發揮作用,其異常表達會影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、分化等多種功能,在胃癌的發生和發展過程中發揮關鍵作用[12-16]。miRNA參與胃癌細胞增殖、分化及凋亡等多個過程,有望成為胃癌早期診斷和預后監測的標靶因子。

Dong等[17]采用qRT-PCR檢測miR-369-3p在胃癌組織中的表達,發現miR-369-3p水平較正常胃組織顯著降低。本研究發現,病例組血清miR-369水平顯著低于健康對照組,預后不良亞組血清miR-369水平顯著低于預后良好亞組,與既往研究結果相似,提示血清miR-369參與胃癌的發生,其低表達可能促進了癌細胞的增殖,且與患者預后不良有關。研究顯示,miR-1323在食管癌組織中呈高表達,并且其表達與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度和淋巴結轉移有關[18]。孫婧悅等[2]研究發現,miR-1323在胃癌組織中的表達顯著高于對照組,經ROC曲線分析其對胃癌診斷的敏感度達100%,AUC為0.908。本研究結果顯示,胃癌患者血清miR-1323水平顯著高于健康對照組,預后不良亞組血清miR-1323水平顯著高于預后良好亞組,其預測胃癌預后不良的AUC為0.823,敏感度為0.947,提示miR-1323高表達參與了胃癌的發生,并且與患者的預后不良關系密切,可作為胃癌預后不良的生物靶標應用于臨床檢測。楊建華等[19]研究發現,較高的TNM分期、淋巴結轉移是胃癌患者預后的危險因素。謝興旺等[20]研究發現,TNM分期、分化程度(低分化)是胃癌患者術后復發的危險因素。本研究經Cox回歸分析,結果顯示miR-369、miR-1323、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度是胃癌患者預后不良的影響因素,與前人研究結果一致,提示miR-369、miR-1323與胃癌患者預后及癌細胞的侵襲、轉移有關。

綜上所述,miR-369在胃癌患者血清中呈低表達,miR-1323呈高表達,二者與患者臨床病理特征相關,聯合檢測對患者預后具有良好的預測價值,并且是患者預后不良的影響因素。本研究局限在于,納入樣本量較少,后續將擴大樣本量進一步探討miR-369與miR-1323在胃癌患者中的作用機制,以期為改善胃癌患者的預后提供新的生物標志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊思雨:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;姜淮蕪:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;姚暉、周航宇:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;馬波:進行統計學分析