宮頸癌中單核細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響

田馨莉，張妍，李嵐，陳芳

作者單位：濰坊市人民醫(yī)院婦科，山東 濰坊261000

宮頸癌是感染型腫瘤，研究已證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒（human papilomas virus，HPV）的持續(xù)感染是其發(fā)病的根本原因［1］，高危型HPV 持續(xù)感染后所致的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，感染導(dǎo)致腫瘤局部的固有免疫發(fā)生變化，免疫細(xì)胞及其分泌的各種免疫因子參與腫瘤的進(jìn)展［2］。

Th17 細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類輔助型T 細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維A 酸相關(guān)孤兒受體γt、分泌特征性的白細(xì)胞介素（IL）-17 發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞既具有促進(jìn)腫瘤的作用，也有抗腫瘤的作用［4-5］。在宮頸癌中，外周血及腫瘤局部微環(huán)境中該細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中，該細(xì)胞的表達(dá)比例均明顯升高，提示在宮頸癌的進(jìn)展中Th17 細(xì)胞可能起到促進(jìn)作用［6］。但是Th17 細(xì)胞在宮頸癌中的分化機(jī)制研究甚少。單核細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，能夠監(jiān)視病原體的入侵，并作為抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞發(fā)揮功能［7］。研究發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、IL-23、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子是誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，而單核細(xì)胞系IL-1、IL-6 的重要分泌來(lái)源［8-9］，因此我們推測(cè)，單核細(xì)胞可能影響Th17 細(xì)胞的分化。本研究旨在探討宮頸癌中單核細(xì)胞對(duì)Th17 細(xì)胞分化的影響，進(jìn)而為宮頸癌的免疫治療提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019 年6 月至2020 年12 月在濰坊市人民醫(yī)院婦科收治的宮頸癌病人（宮頸癌組）39 例，均通過(guò)手術(shù)病理證實(shí)，年齡（50±5.8）歲。對(duì)照組為健康志愿者及因良性疾病在濰坊市人民醫(yī)院婦科就診的病人，共30 例，年齡（48±4.9）歲，對(duì)照組宮頸液基細(xì)胞學(xué)及宮頸HPV 均無(wú)異常。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。排除合并心血管疾病、高血壓病、糖尿病、妊娠、活動(dòng)性或慢性感染、結(jié)締組織疾病病人或有惡性腫瘤病史的病人。宮頸癌組病人均未經(jīng)過(guò)放化療、免疫治療或中醫(yī)中藥治療。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑及儀器初始CD4+T 細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞磁珠分選試劑盒、磁力架、均購(gòu)自德國(guó)Miltenyi 公 司。anti-IL-6、anti-IL-1β、Anti-CD3、anti-CD28、IL-2（均購(gòu)自Peprotech 公 司。percp∕cy5.5-CD4，AlexaFluor647-anti-IL-17（均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司）；佛波酯、離子霉素、莫能霉素（購(gòu)自聯(lián)科生物公司）。IL-1β、IL-6 及IL-23 基因引物由Bio-Sune 生物公司合成。RPMI1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，人的淋巴細(xì)胞分離液（購(gòu)自TBD 公司），RNA核酸提取試劑盒（購(gòu)自Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自Takara）。采用美國(guó)BD Bioscience PharMingen Calibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用美國(guó)ABI公司RTPCR儀（7600）檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌組、對(duì)照組外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá) 取200 μL全血，與200 μL的RPMI 1640 混勻，同時(shí)加入莫能霉素、佛波酯、離子霉素，在孵育箱中孵育4 h（孵育箱條件為37 ℃，5%二氧化碳），取100 μL 刺激后的溶液加入Percp∕cy5.5-CD4 混勻進(jìn)行表面染色，固定破膜后加入AlexaFluor647-anti-IL-17 進(jìn)行染色，加入100 μL 的固定液A，PBS 洗滌、離心后，加入100 μL 破膜液B 液，立即加入AlexaFluor647-anti-IL-17 抗體，磷酸緩沖鹽溶液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17 細(xì)胞的比例。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）方法檢測(cè)兩組外周血中IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá) 首先分離外周血的單個(gè)核細(xì)胞，用Trizol 法裂解單個(gè)核細(xì)胞并提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)成互補(bǔ)DNA（cDNA），熒光定量PCR 按照SYBR Green Realtime PCR MasterMix 試劑盒配成反應(yīng)體系，內(nèi)參為GAPDH。引物序列如下：IL-1β正向引物GTACCTGAGCTCGCCAGTG，反向引物TGTTTAGGGCCATCAGCTT；IL-6 正向引物TTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCA，反向引物AGGGCTGAGATGCCGTCGAGGATGTA。

1.3.3CD4+T 細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞的分選 使用Ficoll 密度梯度離心法分離宮頸癌組和對(duì)照組外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109∕L。嚴(yán)格按照Miltenyi 公司試劑盒進(jìn)行磁珠分選對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞及宮頸癌病人外周血中的CD14+單核細(xì)胞。分選出的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行純度檢測(cè)，均可達(dá)95%以上。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng) 將對(duì)照組外周血中初始CD4+T細(xì)胞以2×105個(gè)∕孔分為2 組在96 孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔。每孔中均加入anti-CD3（2 mg∕L），anti-CD28（1 mg∕L）、IL-2（10I U∕mL）。第一組：加入正常對(duì)照者（15 例）外周血中單核細(xì)胞，與CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)目比例為1∶2；第二組：加入宮頸癌外周血中單核細(xì)胞（15 例），與CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)目比例為1∶2。為研究IL-6 及IL-1β 對(duì)宮頸癌病人Th17 細(xì)胞分化的影響，我們另入組12 例宮頸癌病人，分離宮頸癌外周血中單核細(xì)胞，與對(duì)照組中CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)目比例為1∶2，設(shè)置如下四組：空白對(duì)照組、anti-IL-1β 組、anti-IL-6組、anti-IL-6+anti-IL-1β 組。于孵育箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)5 d（條件為37 ℃，5%二氧化碳），收集各組中的細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組中Th17細(xì)胞的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 22 軟件分析，結(jié)果用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（第25、第75 百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，分析用非參數(shù)分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組中Th17 細(xì)胞的表達(dá)與對(duì)照組（2.3±1.6）%相比，Th17 細(xì)胞比例在宮頸癌組（3.5±1.4）%中明顯升高（t=3.20，P=0.002）。

2.2 兩組中IL-1β、IL-6 表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，宮頸癌組外周血中IL-1β、IL-6 的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），并且IL-1β 的表達(dá)水平與Th17細(xì)胞的比例呈正相關(guān)（r=0.52，P=0.001）。見(jiàn)表1，圖1。

表1 白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6在宮頸癌組、對(duì)照組外周血中的表達(dá)水平∕M（P25，P75）

圖1 宮頸癌組中IL-1β表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例的相關(guān)性

2.3 單核細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響

2.3.1兩組外周血單核細(xì)胞分別與正常對(duì)照者的CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)兩組中Th17 細(xì)胞表達(dá)與對(duì)照組中Th17 細(xì)胞比例（0.90±0.39）相比，宮頸癌組中Th17 細(xì)胞比例（1.77±0.61）明顯升高（t=4.60，P＜0.001，n=15），說(shuō)明宮頸癌病人外周血中的單核細(xì)胞更能促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化（P＜0.05）。

2.3.2宮頸癌病人加入中和抗體的培養(yǎng)組與正常對(duì)照者的CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)三組中Th17 細(xì)胞的比例 與未加中和抗體的空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組三組中Th17 細(xì)胞比例均明顯降低（P＜0.05），且加入anti-IL-1β組與加入anti-IL-6組相比，Th17細(xì)胞下降更為明顯（P＜0.05）。說(shuō)明IL-1β 及IL-6 均對(duì)Th17 細(xì)胞的分化起了重要的作用，而IL-1β 在促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化過(guò)程中的誘導(dǎo)作用可能更強(qiáng)。見(jiàn)表2。

表2 anti-白細(xì)胞介素（IL）-1β、anti-IL-6對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響∕

表2 anti-白細(xì)胞介素（IL）-1β、anti-IL-6對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響∕

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與anti-IL-1β組比較，P＜0.05。

3 討論

Th17 細(xì)胞作為一種輔助型T 細(xì)胞，參與多種炎癥相關(guān)性惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌等［10-13］。Salazar 等［14］在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞在肺癌組織中明顯升高，且與病人的生存率呈負(fù)相關(guān)，體外培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制IL-17的作用可減少上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減緩肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Th17 細(xì)胞在肺癌中發(fā)揮促癌的作用。在一項(xiàng)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17+CD4+T 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)明顯升高，腫瘤組織中IL-17 與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)、腫瘤血管密度呈正相關(guān)，提示IL-17 在乳腺癌的進(jìn)展中起到促進(jìn)作用［15］。Xue等［16］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人中，Th17細(xì)胞的比例隨著腫瘤期別增加而逐步升高，推測(cè)在宮頸癌中，Th17 細(xì)胞可能起到促進(jìn)疾病進(jìn)展的作用。此次我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到宮頸癌病人外周血Th17細(xì)胞比例明顯增加，驗(yàn)證該細(xì)胞在宮頸癌中高表達(dá)，但是Th17細(xì)胞在宮頸癌中的分化尚不明確。

單核細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-6，IL-1β，IL-10等［17-18］，是IL-6，IL-1β的重要分泌來(lái)源。而在原始CD4+T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞的分化過(guò)程中，多種細(xì)胞因子參與其中，主要包括IL-1β，IL-6，IL-23，TGF-β 等。Kuang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，抑制肝瘤小鼠體內(nèi)的單核細(xì)胞所致的炎性環(huán)境，小鼠體內(nèi)的Th17細(xì)胞比例顯著減少，且腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減緩。提示在Th17細(xì)胞的分化過(guò)程中，單核細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子可能發(fā)揮了重要作用。我們通過(guò)qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了宮頸癌病人外周血中表達(dá)較高水平的IL-1β、IL-6，我們推測(cè)宮頸癌病人外周血中的單核細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)這兩種細(xì)胞因子促進(jìn)Th17 的分化。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人中Th17細(xì)胞的表達(dá)水平與IL-1β 的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，推測(cè)IL-1β 可能對(duì)Th17 細(xì)胞的分化起著更重要的作用。我們通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)一步研究單核細(xì)胞、IL-1β、IL-6對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響。

從健康對(duì)照者外周血中分選出CD4+T 細(xì)胞，分別與對(duì)照組和宮頸癌病人外周血中分離出的單核細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組中Th17 細(xì)胞分化的比例明顯升高，表明宮頸癌病人中的單核細(xì)胞更能促進(jìn)Th17 細(xì)胞的分化。為進(jìn)一步研究單核細(xì)胞是否通過(guò)分泌IL-1β 及IL-6 這兩種細(xì)胞因子影響Th17 細(xì)胞的分化，我們?cè)谂c宮頸癌病人單核細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，分別加入抗IL-1β 抗體、抗IL-6 抗體、IL-1β 抗體+抗IL-6 抗體，結(jié)果顯示，與未加中和抗體的空白對(duì)照組相比，加入兩種細(xì)胞因子中和抗體后，Th17 細(xì)胞分化的比例均明顯下降，在加入抗IL-1β 組，Th17 細(xì)胞比例下降較加入抗IL-6 組更為明顯，進(jìn)一步驗(yàn)證在Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，IL-1β 對(duì)Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。

綜上所述，宮頸癌病人外周血中高表達(dá)Th17細(xì)胞，宮頸癌病人中的單核細(xì)胞可能通過(guò)分泌更高水平的IL-β 及IL-6（尤其是IL-1β）促進(jìn)了Th17 細(xì)胞的分化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。但是誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。