子癇前期中性粒細胞胞外誘捕網的形成與血管內皮損傷的相關性研究

藺玉建，徐玉靜，吳振蘭

作者單位：1濰坊醫學院臨床醫學院，山東 濰坊 261042；2濰坊市人民醫院產二科，山東 濰坊261000

子癇前期（PE）是與妊娠相關的一種高血壓疾病，我國產婦PE 發病率約為10%，且有逐年上升的趨勢，是臨床中常見的導致孕產婦和圍產兒發病率和病死率升高的原因之一［1-2］。目前為止，PE 的發病機制尚未完全闡明，缺乏有效的預測方法和預防手段，尋找可以準確評估病情的標志物，對疾病發生機制的闡明、發現新的治療靶點具有重要意義。中性粒細胞是人體循環中最普遍的白細胞，在固有免疫中發揮重要作用，隨著Brinkmann等［3］首次發現中性粒細胞在佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）或白細胞介素-8 的刺激下死亡釋放出一種網狀結構，將之命名為中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）后，近年來關于NETs 的研究越來越多，已有研究證實系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、肺炎鏈球菌肺炎、動脈粥樣硬化及血栓形成等均與NETs 密切相關［4］，同時發現在PE 病人的血液及胎盤絨毛間隙內存在大量NETs［5］，由此推斷NETs 參與PE 的發生。廣泛血管內皮損傷是PE重要的病理變化，本研究探討PE 病人血清NETs 水平與血管內皮損傷的相關性，旨在發現新的與PE 病情相關的標志物，為治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020 年9 月至2021 年9 月間在濰坊市人民醫院產檢并分娩的產婦，在首次被診斷為PE 時納入PE 組（共30 例），選擇同期20～28 周于該院產檢并結束分娩的健康產婦30 例作為Nor-P 組，同期于該院進行孕前檢查的健康未孕婦女30 例作為對照組。三組間研究對象年齡分別為（31.20±3.76）歲、（31.50±3.81）歲、（31.53±4.14）歲，三組年齡差異無統計學意義（F=0.07，P=0.936），PE 組和Nor-P 組孕周分別為（25.28±2.04）周、（25.76±2.40）周，兩組研究對象孕周差異無統計學意義（t=0.83，P=0.410）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準參考《婦產科學》［6］中對PE 的診斷標準：妊娠20周后出現收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg，伴有尿蛋白≥0.3 g∕24 h，或隨機蛋白尿（+），或無蛋白尿但合并下列任何一項者：肺水腫、肝功能損害、腎功能損害、血小板減少、新發的中樞神經系統異常或視覺障礙。

1.3 納入及排除標準納入標準：①符合PE 的診斷標準；②既往無慢性原發性高血壓史及PE 病史；③自然妊娠且單胎妊娠；④孕期無特殊用藥及保胎史。排除標準：①合并妊娠期糖尿病、妊娠期心臟病、妊娠期肝內膽汁淤積癥、妊娠期急性脂肪肝；②合并甲狀腺功能亢進、慢性腎炎、嗜鉻細胞瘤等內科疾??；③合并感染性疾病或惡性腫瘤。

1.4 檢測方法PE 組產婦在初次診斷時留取空腹外周靜脈血標本，對照組及Nor-P 組產婦在入組時留取空腹外周靜脈血標本。采用酶聯免疫吸附法檢測NETs 特異性標志物瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3），血管內皮損傷標志物血管性血友病因子及髓過氧化物酶（MPO）水平。人瓜氨酸組蛋白H3 試劑盒、人血管性血友病因子試劑盒、人髓過氧化物酶試劑盒均由艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司提供。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 觀察指標比較三組研究對象外周血白細胞數量、中性粒細胞數量、NETs水平、血管性血友病因子（vWF）水平、MPO 水平的差異，利用Pearson 檢驗分析PE產婦血清NETs水平與中性粒細胞及內皮損傷的相關性。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，計量數據應用表示，組間比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，組間多重比較用LSD 檢驗，相關性分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血白細胞數量、中性粒細胞數量、血清MPO 含量比較PE組白細胞及中性粒細胞數量、血清MPO含量明顯高于對照組和Nor-P 組。三組婦女血白細胞、中性粒細胞數量，血清MPO 含量的差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組婦女外周血白細胞、中性粒細胞、髓過氧化物酶（MPO）水平比較/

表1 三組婦女外周血白細胞、中性粒細胞、髓過氧化物酶（MPO）水平比較/

注：①與對照組比較，P＜0.001。②與Nor-P組比較，P＜0.001。

2.2 血漿中內皮損傷標志物含量比較PE 組血清NETs含量高于對照組和Nor-P 組（P＜0.05），Nor-P 組與對照組血清NETs 的含量差異無統計學意義（P＞0.05）。PE 組血漿vWF 含量高于對照組和Nor-P 組，Nor-P 組血漿vWF 含量高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組婦女血漿中內皮損傷標志物含量比較/

表2 三組婦女血漿中內皮損傷標志物含量比較/

注：NET為中性粒細胞胞外誘捕網，vWF為血管性血友病因子。①與對照組比較，P=0.706。②與對照組比較，P＜0.001。③與Nor-P組比較，P＜0.001。

2.3 相關性分析

2.3.1PE 產婦血清NETs含量與中性粒細胞的相關性分析 經Pearson 檢驗發現，PE 產婦血清中NETs的含量與白細胞數量、中性粒細胞數量、血清MPO含量均呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 子癇前期產婦血清中NETs與中性粒細胞的相關關系

2.3.2PE 產婦內皮損傷程度與血清NETs含量的相關性分析 經Pearson 檢驗發現，PE 產婦內皮損傷標志物vWF 含量與血清NETs 含量呈正相關（r=0.83，P＜0.001）。

3 討論

NETs 是由活化的中性粒細胞經歷一種特殊的死亡形式（NETosis）后釋放的細胞外的網狀結構，主要由DNA 骨架及結合在上的組蛋白和絲氨酸蛋白酶構成［7］。多個研究證實，NETs 在某些感染性疾病、免疫性疾病中起到負面作用，如Tan 等［8］指出血清NETs 可以作為膿毒血癥病人病情嚴重程度和器官損傷程度的生化指標。近期有研究發現，PE病人胎盤絨毛間隙中檢測到大量NETs 的存在，而胎盤血管閉塞、功能不全可能與此相關［9］。本研究發現：未孕婦女和健康產婦血清NETs 水平無明顯差異，而PE產婦血清NETs水平明顯高于未孕婦女和健康產婦，由此推斷高水平的NETs 參與PE 的發生。同時發現健康產婦血液中白細胞及中性粒細胞輕微升高，PE 的產婦升高明顯。Pearson 相關性分析發現，PE 產婦血清NETs水平與白細胞、中性粒細胞數量呈正相關，說明NETs 的產生與白細胞，特別是中性粒細胞有關。MPO 占中性粒細胞總蛋白的5%，占顆粒蛋白25%［10］，在中性粒細胞被激活時釋放到吞噬小體或細胞外，通過其介導的氧化應激反應來抵御微生物，MPO 在中性粒細胞的胞質中濃度很高并且承載著重要的殺菌作用，被認為是中性粒細胞的主要標志物［11］。為了進一步確定我們的觀點，實驗檢測了三組婦女外周血中MPO 的含量，結果提示PE 病人血清MPO 水平明顯高于未孕婦女和健康產婦，相關性分析提示PE 病人血清NETs 水平與MPO水平呈正相關，由此進一步確定PE 產婦血清NETs的升高來自于中性粒細胞，但NETs 是否是由中性粒細胞產生，需進一步實驗驗證。

目前認為子宮螺旋小動脈重鑄障礙，導致母胎界面氧化應激及炎癥介質的釋放，引起全身廣泛血管內皮細胞受損、功能障礙是PE 發病的中心環節［12-13］。vWF 是由巨核細胞和血管內皮細胞合成，具有黏附功能的多聚糖蛋白，主要儲存在血小板的α顆粒和內皮細胞的Weibel-Palade 小體中［14］，內皮細胞損傷后能夠釋放大量vWF，是血漿中vWF 的主要來源［15］。王聚瑾等［16］指出，vWF 是在血管內皮損傷后調節血栓形成的重要因子，是動脈粥樣硬化的始動因子，能作為血管內皮損傷的標志物。同樣Philippe 等［17］也指出，vWF 可作為COVID-19 病人血管內皮損傷的標志物。Güng?r 等［18］則指出，vWF 在PE 中能較準確地反應血管內皮損傷的程度。因此本研究通過檢測血漿vWF 含量來衡量血管內皮損傷程度，結果顯示健康產婦、PE 產婦血漿vWF 含量高于未孕婦女，PE 產婦血漿中vWF 含量明顯增高，可見PE病人體內存在廣泛的血管內皮損傷。

胎盤在炎癥和氧化應激的刺激下，胎盤合體滋養層細胞釋放大量微粒，微粒通過表達高遷移率族蛋白1 使外周中性粒細胞在胎盤絨毛間隙募集、活化［19］，而活化的中性粒細胞經NETosis 過程產生NETs 調節胎盤蛋白13 參與子宮螺旋動脈重鑄及血管內皮損傷［20］。Ma 等［21］研究指出，NETs 的主要蛋白成分可以通過直接破壞細胞間的黏附連接并重組肌動蛋白細胞骨架，引起血管屏障功能障礙和血管微滲漏。本研究中發現PE產婦血清中NETs水平與血漿中vWF 水平都明顯增高，且呈正相關，證實NETs 可以引起PE 產婦的血管內皮損傷，其含量的高低可以反映病情的嚴重程度。

綜上所述，PE 病人血清中NETs 的水平升高與母體內皮損傷程度密切相關，可能是導致PE發生發展的原因之一。NETs作為治療靶點，可能成為治療PE的新方式，但該論點需后續進一步驗證。