基于血管緊張素Ⅱ/一氧化氮信號通路探究N-芐苯乙烯胺對妊娠期高血壓模型大鼠的干預機制

劉艷，劉曉夏，朱一麟

作者單位：1武漢市第一醫院婦產科，湖北 武漢 430022；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院婦產科，湖北 武漢430022

妊娠期高血壓（HDCP）是一種妊娠期女性特有疾病［1-3］。有研究表示，我國女性生育平均年齡呈現上升趨勢，HDCP 發病率也一直居高不下，因此越來越多的專家學者致力于HDCP 臨床治療的研究［4-5］。有研究顯示，酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）∕信號傳導和轉錄激活因子3（STAT3）∕細胞因子信號轉導抑制因子1（SOCS1）通路與細胞分化、血管內皮損傷等密切相關，血管內皮損傷在HDCP 的發生發展過程中發揮重要作用［6］。本研究于2021年1—5月設計、實施實驗，建立HDCP 大鼠模型，使用JAK2 抑制劑N-芐苯乙烯胺（AG490）進行干預，觀察干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取30只SD 健康雌性大鼠及10只SD 健康雄性大鼠［湖南中醫藥大學第一附屬醫院，使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010］，周齡范圍8～9 周，周齡（8.5±0.4）周；體質量范圍219～237 g，體質量（228.2±7.2）g，在溫度（24.1±2.8）℃環境中飼養，光照12 h∕d。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2主要試劑 小鼠抗兔血肌酐、血尿素氮抗體（Hyclone 公司）；小鼠抗大鼠C 反應蛋白（CRP）抗體（BD 公司）；兔抗大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）抗體（Selleck 公司）；大鼠抗小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、一氧化氮（NO）抗體（Dako 公司）；大鼠抗小鼠過氧化脂、過氧化氫酶（CAT）（Gibco 公司）；兔抗大鼠JAK2、STAT3 抗體（Sigma 公司）；小鼠抗兔SOCS1 抗體（Invitrogen公司）。

1.2 建模及分組自30只SD健康雌性大鼠中采用隨機數字表法挑選10只雌鼠為正常組，不做任何處理。其余20 只雌鼠建立HDCP 模型：以2∶1 比例將20只雌鼠與10只雄鼠合籠過夜，次日清晨對雌鼠進行陰道涂片檢查，發現精子即為孕鼠，未發現精子則繼續與雄鼠合籠，直至檢查發現陰道出現精子。所有大鼠于孕12 d 皮下注射125 mg·kg-1·d-1一氧化氮合成酶抑制劑，正常組大鼠皮下注射同劑量蒸餾水，孕鼠出現血壓升高、蛋白尿情況為建模成功。使用隨機數字表法將20 只HDCP 大鼠分為HDCP組、AG490 組各10 只，孕18 d 起，AG490 組大鼠腹腔注射5 mg∕kg AG490，正常組、HDCP 組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠均連續干預7 d。

1.3 指標檢測

1.3.1血壓水平檢測 于大鼠受孕20 d 時使用微動脈血壓檢測儀檢測大鼠尾動脈收縮壓、舒張壓水平，計算平均動脈壓。所有大鼠在呼吸平穩狀態下檢測5次，取平均值。

1.3.2腎功能指標檢測 取各組大鼠腹部靜脈血3 mL，2 000 r∕min 離心15 min 后-40 ℃保存。免疫透射比濁法，340、700 nm 波長處測定免疫復合物濁度，計算血肌酐、血尿素氮水平。收集大鼠24 h 尿液，使用酶法檢測各組大鼠24 h尿蛋白。

1.3.3酶聯免疫吸附實驗法檢測炎癥反應、氧化應激指標及AngⅡ、NO 水平 對酶標板進行標記，設置對照、標準、測定孔，對照孔加終止液、顯色劑，標準孔內加入稀釋后的標準品，測定孔內加血清及抗體，封膜后震蕩均勻，使用37 ℃保溫箱保存，1 h 后去膜清洗，將水分吸干后三孔均加入顯色劑震蕩，顯色后添加終止液，450 nm 處測吸光值，計算CRP、IL-1β、過氧化脂、CAT、AngⅡ、NO水平。

1.3.4胎鼠情況觀察 各組大鼠麻醉后進行剖宮產，取出胎鼠及胎盤組織，檢測各組大鼠胎鼠體長、體質量及胎盤質量。

1.3.5蛋白質印跡法檢測JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白相對表達量 取各組大鼠胎盤組織，提取50 μg 蛋白，煮至蛋白變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳處理，依據蛋白分子將凝膠切開、轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封閉液（Western）室內封閉待測、內參蛋白，1.5 h 后添加待測蛋白抗體（1∶1 000）、內參抗體（1∶2 000），孵育24 h后取出，使用Western 洗滌液清洗5 次，添加山羊抗兔抗體（1∶5 000），Western 洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像，檢測JAK2、STAT3、SOCS1相對表達量。

1.4 統計學方法使用SPSS 26.0 軟件分析，計量資料采用描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，進行單因素方差分析，組間采用LSD-t檢驗比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠血壓、平均動脈壓水平比較如表1所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠血壓、平均動脈壓水平較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠血壓、平均動脈壓水平較低（P＜0.05）。

表1 三組大鼠血壓水平比較∕（mmHg，）

表1 三組大鼠血壓水平比較∕（mmHg，）

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.2 三組大鼠腎功能比較如表2 所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平較低（P＜0.05）。

表2 三組大鼠腎功能比較∕

表2 三組大鼠腎功能比較∕

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.3 三組大鼠炎癥反應、氧化應激指標水平比較如表3所示，與正常組比較，HDCP組、AG490組大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較高，CAT 水平較低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較低，CAT水平較高（P＜0.05）。

表3 三組大鼠炎癥反應、氧化應激指標水平比較/

表3 三組大鼠炎癥反應、氧化應激指標水平比較/

注：CRP為C反應蛋白，IL-1β為白細胞介素-1β，CAT為過氧化氫酶，HDCP為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.4 三組大鼠胎盤質量、胎鼠體長、體質量比較如表4所示，與正常組比較，HDCP組、AG490組大鼠胎盤質量、胎鼠體長、體質量較低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490組大鼠胎盤質量、胎鼠體長、體質量較高（P＜0.05）。

表4 三組大鼠胎盤質量，胎鼠體長、體質量比較∕

表4 三組大鼠胎盤質量，胎鼠體長、體質量比較∕

注：HDCP為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較如表5 所示，與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠AngⅡ水平較高，NO 水平較 低（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠AngⅡ水平較低，NO 水平較高（P＜0.05）。

表5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較/

表5 三組大鼠AngⅡ、NO水平比較/

注：AngⅡ為血管緊張素Ⅱ，NO 為一氧化氮，HDCP 為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

2.6 三組大鼠JAK2/STAT3/SOCS1 通路蛋白表達比較與正常組比較，HDCP 組、AG490 組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相對表達量較高（P＜0.05）；與HDCP 組比較，AG490 組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1相對表達量較低（P＜0.05）。見表6，圖1。

圖1 三組大鼠JAK2、STAT3、SOCS1表達的蛋白質印跡法檢測結果

表6 三組大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表達比較∕

表6 三組大鼠JAK2∕STAT3∕SOCS1通路蛋白表達比較∕

注：JAK2 為酪氨酸蛋白激酶2，STAT3 為信號傳導和轉錄激活因子3，SOCS1 為細胞因子信號轉導抑制因子1，HDCP 為妊娠期高血壓，AG490為N-芐苯乙烯胺。①與正常組比較，P＜0.05。②與HDCP組比較，P＜0.05。

3 討論

HDCP 癥狀若得不到及時有效的控制，病情嚴重的病人甚至可能最終發展為多器官功能衰竭，嚴重威脅妊娠結局甚至孕婦生命安全［7-8］。藥物治療為常用的治療HDCP 的手段，但是尚無一種特效的治療HDCP 的藥物，加之妊娠期的特殊性，導致HDCP 癥狀臨床治療難度較大［9-11］。本研究顯示，HDCP大鼠血壓、平均動脈壓水平較高，使用AG490 干預的HDCP 大鼠血壓、平均動脈壓水平較低。有學者在研究中表示，隨著HDCP的發生發展，血壓水平出現一定程度的上升，抑制HDCP 病人血壓水平上升對HDCP 病人妊娠結局的改善具有重要意義［12-13］。本研究結果說明，HDCP 大鼠血壓水平異常升高，使用AG490 干預能夠降低HDCP 大鼠血壓水平，分析其原因可能是在AG490 的干預下，HDCP 大鼠平滑肌松弛，外周血管阻力下降，從而出現血壓水平下降的結果。

本研究發現，HDCP 大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平相對較高，使用AG490 干預的HDCP大鼠24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平則相對較低。隨著HDCP 的發展，機體腎功能會出現一定程度的損傷，改善腎功能在HDCP 病人病情恢復中具有重要作用［14-15］。24 h 尿蛋白、血肌酐、血尿素氮為常用的評價腎功能的指標。本研究說明，HDCP 大鼠腎功能出現損傷，在AG490的干預下，HDCP 大鼠腎功能損傷情況減輕，針對此研究結果，推測其原因可能是AG490干預起到了抑制HDCP大鼠鈣離子內流、擴張平滑肌的作用，從而改善HDCP 大鼠腎功能。

本研究發現，HDCP 大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平較高，CAT 水平較低，使用AG490 干預的HDCP大鼠CRP、IL-1β、過氧化脂水平下降，CAT 水平上升。有研究表示，HDCP 癥狀的發生發展伴隨著一定程度的炎癥反應、氧化應激反應［16-18］。CRP、IL-1β為廣譜炎癥指標，過氧化脂、CAT 常用于氧化應激反應的評價。本研究說明，HDCP 大鼠出現明顯的炎癥反應、氧化應激反應，在AG490 的干預下，HDCP 大鼠炎癥反應、氧化應激反應嚴重程度減輕，說明AG490 干預能夠通過減輕HDCP 大鼠炎癥反應、氧化應激反應起到干預效果。

本研究發現，HDCP 大鼠AngⅡ水平相對較高，NO 水平相對較低，使用AG490 干預的HDCP 大鼠AngⅡ水平下降，NO 水平上升。HDCP 癥狀的發展伴隨著機體血管內皮收縮、舒張功能障礙［19-20］。本研究說明，HDCP 大鼠血管內皮收縮、舒張功能出現明顯異常，在AG490的干預下，HDCP 大鼠血管內皮功能得到有效提升。有學者通過動物實驗研究表示，抑制JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表達能夠起到提升妊高癥大鼠血管內皮功能的作用［21］。基于此，本研究對JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白進行檢測，發現HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 相對表達量較高，使用AG490 干預的HDCP 大鼠JAK2、STAT3、SOCS1 表達下調，說明AG490 干預能夠靶向調控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路，從而達到改善大鼠內皮功能的目的。

綜上所述，使用JAK2抑制劑AG490對HDCP模型大鼠進行干預，能夠改善大鼠血壓水平、腎功能水平，減輕炎癥反應、氧化應激減輕，改善胎鼠狀況，大鼠內皮功能得到提升，其原因可能是AG490能夠調控JAK2∕STAT3∕SOCS1 通路蛋白表達，為后續研究提供了一定的理論依據。