同源四倍體甜蕎誘導方法研究

趙建棟, 李秀蓮, 陳穩良, 史興海, 劉曉東, 秦秀珍

(1.山西農業大學農業基因資源研究中心, 太原 030031;2.山西農業大學農學院, 太原 030031)

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)生育期短、適應性廣、耐旱、耐瘠,可種植于多種逆境脅迫環境。甜蕎食藥同源,籽粒蛋白質含量高,而且人體必需的氨基酸種類齊全、數量多、比例合適;籽粒富含蘆丁,蘆丁具有擴張血管、抗栓塞、降血脂、膽固醇,防治心腦血管疾病的作用[1],是功能食品原料源。因此,甜蕎是無可替代的特色雜糧作物。據不完全統計,全國育成的甜蕎品種約35個,主要是二倍體品種(33個)[2]。而多倍體水稻[3]、谷子[4]、高粱[5]、哈密瓜[6]等育種研究表明,由于染色體加倍后產生的劑量效應,具有提高產量、品質的潛力,多倍體甜蕎育種越來越受到育種者重視。

據報道,國外主要是用秋水仙素溶液處理蕎麥干種子選育四倍體蕎麥品種,如美國在20世紀30年代育成了四倍體蕎麥品種Penquad[7];國內李德利等[8]用秋水仙素溶液處理甜蕎發芽種子,創制四倍體甜蕎種質;趙鋼等[9-10]、楊敬東等[11]、 廉立坤[12]用秋水仙素溶液處理苦蕎幼苗獲得了四倍體苦蕎品系和種質;前人用秋水仙素溶液處理甜蕎幼苗獲得了四倍體甜蕎品種和品系[13-19]。不同甜蕎誘導方法的研究中,其誘導效果參差不齊。因此,本試驗同時用不同濃度秋水仙素溶液處理二倍體甜蕎親本干種子、發芽種子和幼苗,創制四倍體甜蕎新品系,旨在研究誘導同源四倍體甜蕎最佳方法,供蕎麥育種者參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試甜蕎品種為品甜蕎1號(山西農業大學農業基因資源研究中心)和西農9976(西北農林科技大學農學院);試驗器材有顯微鏡、燒杯、量筒、滴管、棕色瓶、小燒杯、吸管、脫脂棉、鑷子等。誘變試劑采用秋水仙素粉劑(由上海試劑化工廠進口分裝),用蒸餾水配成0.1%、0.2%和0.3%三種濃度的液體分別貯于3個棕色瓶內,備用。

1.2 方 法

1.2.1多倍體誘導處理

用三種濃度0.1%(B1)、0.2%(B2)和0.3%(B3)的液體分別對甜蕎品種品甜蕎1號和西農9976干種子(大而飽滿)(A1)、發芽種子(胚根長度≤0.5 cm)(A2)和幼苗(兩片子葉剛展開)(A3)進行處理: 1) 把干種子分別放入三種濃度的秋水仙素溶液中,在夏季常溫下浸24 h,然后分別播種于10個大號花盆內,每盆播5粒種子;設對照(ck 1),干種子用蒸餾水(濃度0)(D)浸種24 h,然后在4個花盆中每盆播種5粒種子。 2) 把發芽種子在夏季常溫下分別浸入三種濃度的秋水仙素溶液中16 h,然后按處理藥液的不同濃度分別播種在10個大號花盆內,每盆播5粒發芽種子;設對照(ck 2),將20粒發芽種子浸入蒸餾水中16 h后播于4個花盆中。 3) 在30個長幼苗的大號花盆中,每盆均勻地留5株,拔除其余幼苗。當幼苗子葉完全展開時,把分別浸透三種濃度藥液的脫脂小棉球夾在葉柄中間的生長點,每種濃度各處理10盆,每天早晚各處理1次,每次滴幾滴藥液浸透棉球,連續2～3 d,處理時氣溫夏季常溫;設對照3(ck 3),用蒸餾水處理4個花盆中的20株幼苗生長點,每天早晚各處理1次,每次滴幾滴藥液浸透棉球,連續2～3 d,處理時氣溫夏季常溫如表1。設對照(ck 1),蒸餾水(藥物濃度0)浸種24 h,然后在4個花盆中每盆播種5粒種子。

表1 各處理及對照設置Table 1 Treatments and control setting

處理與對照均計算植株加倍率和誘導率。

加倍率/%=[加倍成功株數(收到1粒及1粒以上加倍種子的植株)/成活株數]×100%;

1.2.2多倍體甜蕎形態特征鑒定

每個處理當代(C 1)多倍體和二倍體(對照)在幼苗期、花期和成熟期分別對胚軸、子葉、真葉、花和籽粒的形狀、大小、顏色等進行觀察、比較、記載、拍照和掛牌。

1.2.3多倍體甜蕎農藝性狀鑒定

為了檢驗C 1多倍體遺傳特性,避免變異分枝在膨大節處折斷以及獲得更多多倍體籽粒,所以在第二代(C 2)和第三代(C 3)繼續觀察每個處理多倍體真葉大小、葉色深淺、薄厚、花的花瓣形狀、大小、顏色深淺,在盛花期測量葉面積(葉片最長度×葉片最寬度)并記載單株葉片數;成熟期測量多倍體株高、莖粗(植株底部第一節間中部周長)、主莖分枝、單株粒重、千粒重、結實率、生育期,并與對照二倍體比較。

1.2.4多倍體細胞學鑒定

在實驗室用顯微鏡測定多倍體花粉粒、葉片保衛細胞、氣孔密度的大小,用常規根尖壓片觀察染色體數目,與二倍體親本進行比較。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素誘導效應

2.1.1不同處理時期的誘導效應

目前，雖然圖書館在信息服務方面取得了長足進展，服務功能越來越全面，數字資源建設初見成效，但是各高校圖書館在公眾號建設內容和建設思路方面高度一致，缺少有特色的信息服務和針對各自師生定制化的信息推送服務，在后續的建設過程中，圖書館在完善數字資源的同時，需要深入研究用戶行為數據挖掘技術，對用戶數據進行分析、歸類，根據用戶需求作出分類向導及決策，提供定制化推薦、檢索、推送等服務。具體舉措如下[4-5]。

以A1、A2、A3分別代表種子、發芽種子和苗期處理,不同處理時期染色體加倍效應如表2。

由表2可以看出,A2處理加倍率(52.7%)最高,但處理后死亡株數(76株)也最高,故不能獲得最好的處理效果。A1處理雖然死亡株數(16株)低,但加倍率(19.4%)也最低,因此處理效果也不理想。A3處理加倍率(45.5%)較高,雖然略低于A2處理的加倍率,但成活株數(110株)遠比A2處理(74株)多,故A3處理效果(33.3%)最佳。

表2 處理時期(A)的不同效應Table 2 Different effects of treatment period (A)

2.1.2不同濃度的誘導效應

用B1、B2、B3分別代表處理藥液秋水仙素的濃度0.1%、0.2%和0.3%,不同濃度處理染色體加倍效應如表3。

表3 藥物濃度(B)不同水平的效應Table 3 Drug concentration (B) effects at different levels

由表3可知,B1處理時,雖然死亡數最少(43株),但加倍率(35.34%)最低,處理效果最差;B3處理時,加倍率(60.0%)最高,但植株的死亡株數(80株)也最高,故不能獲得最好的處理效果。B2處理時,加倍率(46.67%)較高,雖然低于B3處理的加倍率,但成活株數(105株)遠比B3處理(70株)多,故0.2%濃度藥液處理效果(32.66%)最佳。

2.1.3處理時期和藥液濃度二因素誘導效應

處理總數相同的情況下,不同處理時期和不同藥液濃度處理后的加倍成功株數、成活株數和加倍率如表4。

表4表明,植株成活率從處理時期看A1>A3>A2,從藥物濃度看B1>B2>B3,可見植株成活率以組合A1B1為最高,組合A2B3最低。在處理總數一致的情況下, 更重要的是看誘變成功的株數,由A1→A2→A3和B1→B3→B2誘變成功株數遞增,以A3B2為最高,A1B1為最低。綜上,處理時期和藥物濃度的最佳組合是A3B2,其次是A3B3,第三是A3B1。植株成活株數以A1B1(47株)為最高,但加倍率(14.9%)最低;A3B3加倍率(82.6%)最高,但加倍成功株數(19株)和成活株數(23株)均不是最高;A3B2誘變成功株數(23株)最高,成活株數(35株)和加倍率(65.7%)均相對較高。可見加倍率最高的加倍成功株數不一定最高,不能一味追求加倍率,更重要的是同時考慮加倍成功株數和成活株數。綜上,處理時期和藥物濃度的最佳組合是A3B2。說明0.2%濃度的藥液處理幼苗生長點效果最佳。

ck 1處理20粒種子存活18株,加倍成功0株。

ck 2處理20粒發芽種子存活17株,加倍成功0株。

ck 3處理20株幼苗存活18株,加倍成功0株。

ck 1、ck 2和ck 3之間無明顯差異,說明秋水仙素是甜蕎染色體加倍的有效藥物。

2.2 多倍體形態特征

2.2.1處理當代(C 1)形態特征

秋水仙素水溶液處理甜蕎當代在整個生育過程變異均較為明顯,首先是幼苗期變異植株主莖生長點伸長受抑制、進而膨大,胚軸加粗、顏色加深(深紫色)、子葉變厚、顏色加深(深綠),從膨大節長出的真葉皺縮、葉緣不整齊、葉色變深,有的在膨大節停止生長、子葉變紫、最后干枯死亡;變異植株生長到現蕾期,真葉變厚、顏色變深、葉脈顏色變深、葉片變大、但植株由于藥劑作用影響生長、故株高變矮;變異植株花期花瓣前端變鈍、花瓣變長、變寬、花變大、顏色變深;最后成熟期籽粒變長、變寬、變大(圖1)。

注:A為主莖生長點膨大;B為幼莖增粗、顏色變深;子葉變厚、顏色變深;真葉皺縮葉緣不齊; C為子葉顏色變紫;D為幼苗期對照植株;E為真葉變厚、顏色變深、葉脈顏色變深、葉片變大;F為現蕾期對照植株; G為花瓣先端變鈍、花瓣變長、變寬、花變大、顏色變深;H為對照花;I為籽粒變長、變寬、變大;J為對照籽粒。圖1 秋水仙素誘導甜蕎形態變異情況Fig.1 Morphological variation of common buckwheat induced by colchicine

2.2.2處理第二代(C 2～C 4)形態特征及農藝性狀

處理C 2代變異植株繼續延續真葉特別是心葉皺縮、葉緣不整齊、葉片變厚、變大、葉色變深、花瓣先端變鈍、花瓣變長、變寬、花變大、顏色變深、籽粒變大的特征,而且變異新株系QP1-1-1和QXN-3-2植株生長勢增強,株高分別比親本高9.0 cm和7.4 cm,莖稈分別增粗0.13 cm和0.12 cm,葉面積分別增加133.0 cm2和103.0 cm2,葉片數分別減少15.0片和16.0片,主莖分枝分別增加1.6個和1.7個,生育期分別延長5 d和7 d,千粒重分別增加25.5 g和23.1 g,結實率分別下降了2.2%和4.7%(表5)。田間鑒定顯示了多倍體特性。C 2～C 4連續3代鑒定,形態特征和農藝性狀趨于一致,說明四倍體甜蕎遺傳穩定。

2.3 多倍體花粉粒、氣孔、保衛細胞和染色體

實驗室觀察變異新株系QP 1-1-1和QXN-3-2的花粉粒比各自親本分別增大9.6 μm×13.8 μm和9.6 μm×11.3 μm;葉片保衛細胞分別增大5.5 μm×5.3 μm和4.3 μm×3.3 μm;氣孔密度分別下降38個/mm2和35個/mm2,幅度大(表6)。變異新株系QP 1-1-1和QXN-3-2種子根尖細胞染色體數均為2 N=4 X=32,而各自親本染色體數均為2 N=2 X=16用0.1%、0.2%和0.3%的秋水仙素水溶液分別處理親本二倍體甜蕎品種(染色體2 N=2 X=16)干種子、發芽種子、幼苗,均能獲得生育期更長、株高增加、莖稈增粗、葉片增大、籽粒顯著增大、結實率有所下降的四倍體甜蕎(染色體2 N=4 X=32)。說明,到目前為止,秋水仙素仍然是誘導蕎麥染色體加倍的較好藥物。在處理總數相同的情況下,處理干種子法雖然簡單易行,方便操作,死亡株(16株)少,但加倍率(19.4%)最低;處理發芽種子法也操作簡單方便,加倍率(52.7%)最高,但死亡株數(76株)也最高;處理幼苗法雖然操作繁瑣,還要求操作者有一定技術水平,并且易受雨、風、苗情等外界因素影響,但加倍率(45.5%)較高,成活株(110株)也多,況且通過采取調節密度、出苗后處理時遇雨打傘、處理后單株幼苗蓋上大小合適的玻璃杯等措施,可以避免或減少外界環境因素影響。幾種方法比較結果,處理幼苗法是創制同源四倍體甜蕎新種質的最有效方法,且0.2%秋水仙素水溶液處理幼苗效果最佳。四倍體甜蕎與親本比較,生育期延長、株高增高、結實率下降,所以在進行多倍體甜蕎選育時應選擇生育期較短、矮稈、結實率較高的二倍體甜蕎做親本。

注:K為QP 1-1-1染色體;L為對照品種甜蕎1號染色體;M為QXN-3-2染色體;N為對照西農9976染色體。圖2 秋水仙素誘導甜蕎染色體Fig.2 Chromosome induction of common buckwheat by colchicine

表4 處理時期(A)與藥物濃度(B)的共同效應Table 4 Common effects of treatment period (A) and drug concentration (B)

表5 甜蕎四倍體株系和二倍體品種性狀比較(10株平均值)Table 5 Comparison of traits between tetraploid lines and diploid varieties of common buckwheat (mean of 10 plants)

(圖2和圖3)。室內鑒定變異新株系QP 1-1-1和QXN-3-2顯示了多倍體特性。連續3代鏡檢,新株系QP 1-1-1和QXN-3-2根尖細胞中的染色體數目保持不變,說明四倍體甜蕎遺傳穩定。

表6 甜蕎四倍體品系和二倍體品種花粉粒、保衛細胞和氣孔密度Table 6 Pollen grains, guard cells and stomatal density of tetraploid lines and diploid varieties of common buckwheat

3 結論與討論