HIRA 基因突變對綿羊顆粒細胞中mRNA和蛋白表達及細胞激素分泌的影響

周 梅,劉秋月,孫 慶,田志龍,向光明,狄 冉,王翔宇,儲明星*

(1 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,農業農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,北京 100193;2 安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所,豬分子數量遺傳學安徽省農業科學院重點實驗室,畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室,合肥 230001)

產羔數是綿羊最重要的經濟性狀之一,其對綿羊繁殖力遺傳的貢獻為74%—96%[1-3],是衡量母羊生產性能的關鍵指標。 潘章源等[1]對10 個中國地方綿羊品種進行全基因組重測序,篩選到了組蛋白細胞周期調節(histone cell cycle regulator,HIRA)基因。HIRA基因編碼的HIR∕HIRA 蛋白是組蛋白的伴侶蛋白,該蛋白參與各種染色質調節過程,如基因轉錄和精子染色質的重塑[2-3]。 在真核生物中,DNA 與組蛋白結合形成核小體這種穩定的結構,從而參與各種生物學過程(如DNA 復制、修復和轉錄,成肌細胞分化,心臟發育和胚胎發育)[4-8]。 研究發現,在小鼠和魚類胚胎發育過程中,HIRA基因對于組蛋白與DNA的結合尤為重要[9-11]。HIRA基因對于染色質組裝過程中H3.3 變異體的沉積至關重要,該基因缺失會影響H3.3∕H4 的置換,并影響精子染色質的組裝,從而影響小鼠受精[12-16]。 在小鼠胚胎發生中,HIRA 蛋白失活會引起妊娠中期胚胎死亡[17]。 Buhe 等[9]和Veselovska 等[18]研究發現,HIRA 蛋白對于小鼠卵子發生過程中的轉錄調控和DNA 甲基化至關重要,原始卵泡細胞中HIRA 蛋白缺失可導致發育嚴重缺陷,從而使卵母細胞大量死亡。HIRA基因一個點突變可使果蠅雌性不育,阻止受精后精核的解凝,導致父本染色體無法參與后代胚胎發育[19-22]。 郭秋紅等[23]研究發現,HIRA基因主要參與受精或胚胎發育過程,對卵子發生或減數分裂并沒有顯著影響。

HIRA基因mRNA 表達在不同產羔數綿羊繁殖相關組織間顯著差異,且該基因的g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點均與小尾寒羊產羔數存在顯著關聯[13]。 本試驗通過研究g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點對不同HIRA基因型綿羊卵巢顆粒細胞中mRNA 和蛋白表達水平以及生殖激素濃度的影響,以探究HIRA基因突變與綿羊產羔數之間可能存在的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和RNA 提取

綿羊卵巢組織取自河北南營屠宰場。 采用動物組織∕細胞微量RNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]加Trizol(Invitrogen 公司,美國)提取各組織總RNA,使用Nanodrop 2000 檢測提取RNA 的濃度和OD 值,并采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。

1.2 引物設計

根據GenBank 提供的綿羊HIRA基因mRNA 的轉錄本序列(登錄號為:XM_012164242.2),利用Primer 3 在線軟件設計HIRA基因突變位點分型和熒光定量所需引物,以β-actin(NM_001009784)作為內參基因。 引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成,測序由北京華大生物科技有限公司完成。 引物具體信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 綿羊卵巢顆粒細胞的獲取和培養

將綿羊卵巢置于4 ℃的1 ×PBS 緩沖液(Gibco 公司,美國)中帶回實驗室,用75%(體積分數)乙醇洗滌2 次(每次5—10 s),然后用0.9%(質量分數)的生理鹽水洗滌3 次,最后將卵巢置于含有生理鹽水+1%(體積分數)青鏈霉素(Gibco 公司,美國)的混合液中,37 ℃水浴。 小心取出卵巢,用滅菌的10 mL 注射器吸取0.5 mL 完全培養基[完全培養基按照DMEM(HyClone 公司,美國)、胎牛血清(Gibco 公司,美國)和青鏈霉素分別為84%、15%和1%的體積比例進行配制)],從卵泡(直徑＞3.0 mm)中吸出含有顆粒細胞的卵泡液樣品,將混合液依次打入4 孔板(Costar,Cambridge,MA,USA)中并做好標記,然后置于37 ℃、5%(體積分數)的二氧化碳培養箱中。

1.4 卵巢組織DNA 提取及基因分型

取綠豆大小卵巢組織,利用動物組織DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。通過測序對每個卵巢組織HIRA 基因g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點進行基因分型。

1.5 顆粒細胞激素測定和HIRA 基因表達

待培養皿中細胞密度達到80%左右,將培養液更換為不含血清的培養基,并將該換液時間記為0 h,48 h 時收集細胞培養液,送至北京北方生物科技有限公司利用放射免疫的方法檢測細胞培養液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的含量。 剩余的細胞用于提取RNA,利用qPCR 方法檢測g. 71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點不同HIRA 基因型在綿羊顆粒細胞中的mRNA 表達情況。 反應體系為20 μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上下游引物各0.8 μL,cDNA 模板2.0 μL,ddH2O 6.4 μL。 反應程序為:95 ℃預變性5 s;95 ℃變性5 s,60 ℃30 s,40 個循環;反應結束后分析熔解曲線。 qPCR 檢測利用Roche Light Cycler? R480Ⅱ型熒光定量PCR 儀進行,每個樣品重復3 次。

1.6 免疫熒光試驗

采用免疫熒光法檢測HIRA 蛋白在綿羊卵巢顆粒細胞中的表達。 用4%(質量分數)多聚甲醛固定細胞并用1 ×PBS 清洗3 次后,向清洗后的培養皿每孔加入100 μL 封閉液1[5 mL 封閉液1:500 μL 山羊血清(Abcam 公司,英國) +4.5 mL 1%的BSA(用1 ×PBS 稀釋) (北京經日今典科技有限公司) +5 μL 1%Triton-100(用1 ×PBS 稀釋) (北京經日今典科技有限公司)],封閉20 min。 吸出封閉液1,加入一抗(Abcam 公司,英國) 100 μL(一抗∶封閉液1 =1∶200),4 ℃冰箱中放置過夜。 吸出一抗,用1 ×PBS 輕柔地清洗3 次。 向清洗后的培養皿每孔加入200 μL 二抗(Abcam,英國)(二抗∶封閉液2 =1∶1 000;5 mL 封閉液2:400 μL 山羊血清+4.6 mL 1%的BSA +5 μL 1% Triton-100),在黑暗中放置1 h。 吸出二抗,用1 ×PBS 輕柔地清洗3 次。 向清洗后的培養皿每孔細胞表面加入15 μL ProLong(Life 公司,美國)和Hoechst(Hoechst AG 公司,德國)混合液,蓋上圓形蓋玻片,用錫箔紙包好后放置于4 ℃冰箱。 HIRA 蛋白表達陽性率=陽性表達的細胞數∕總細胞數。 共統計18 個樣本中HIRA 的表達情況(20 倍鏡),包括g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點各3 種基因型,每種基因型設3 個生物學重復。

1.7 數據分析

采用2-ΔΔCt法[24]計算目的基因相對表達量,利用SPSS 20 軟件中LSD 法對不同組別之間mRNA 和蛋白表達以及激素濃度進行差異比較分析,所有數據以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 不同HIRA 基因型綿羊顆粒細胞mRNA 和蛋白表達

qPCR 檢測結果表明(圖1),g.71874104G ＞A 位點各基因型顆粒細胞之間HIRA 的表達量GG 型最高,其次是GA 型,AA 型最低,但三者之間差異均不顯著(P＞0.05)。 而g.71833755T ＞C 位點則是TT 型顆粒細胞中HIRA的表達量最高,其次是TC 型和CC 型,且TT 型顯著高于TC 和CC 型(P＜0.05),TC 和CC 型之間差異不顯著。 由圖2 可知,HIRA 蛋白在原代培養的綿羊卵巢顆粒細胞的細胞核中呈中度表達。 從表2 可以看出,g.71874104G ＞A 突變位點GG 型顆粒細胞中HIRA 蛋白表達量最高,其次是AA型,GA 型最低且極顯著低于GG 和AA 型(P＜0.01);g.71833755T ＞C 突變位點TT 型顆粒細胞中HIRA蛋白表達量最高,其次是TC 型,CC 型最低,且3 種基因型之間均差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 不同HIRA 基因型在綿羊顆粒細胞中的表達Fig.1 Expression of HIRA gene with different genotypes in ovine granulosa cells

圖2 綿羊顆粒細胞中HIRA 蛋白表達情況Fig.2 Expression of HIRA protein in ovine granulosa cells

表2 g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型綿羊顆粒細胞中HIRA 蛋白表達Table 2 HIRA protein expression in ovine granulosa cells with different genotypes of g.71874104G ＞A and g.71833755T ＞C mutations

2.2 HIRA 基因突變對綿羊顆粒細胞中重要生殖激素分泌的影響

由圖3 可以看出,g.71874104G ＞A 突變位點各基因型綿羊卵巢顆粒細胞GG 型P4 的分泌量顯著高于GA 和AA 型(P＜0.05),GA 和AA 型之間無顯著差異;GA 型E2 的分泌量顯著高于GG 和AA 型(P＜0.05),GG 和AA 型之間無顯著差異。 g.71833755T ＞C 突變位點各基因型之間P4 和E2 的分泌量均無顯著差異(P＞0.05)。

圖3 g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型顆粒細胞激素分泌Fig.3 Hormone secretion of different genotypes of granulosa cells for g.71874104G ＞A and g.71833755T ＞C mutations

3 討論

研究表明,HIRA基因對脊椎動物的胚胎發育至關重要,該基因缺失會導致小鼠胚胎死亡[4,25]。HIRA基因是一個保守的不依賴于DNA 復制的染色質裝配因子,在果蠅受精過程中發揮著特殊作用,對受精過程中父本染色質組裝尤為重要[26]。 同果蠅一樣,小鼠的母本HIRA基因對其發育也尤為重要,它能夠將組蛋白變體H3.3 摻入父本基因組中進而參與合子的發育[27-28]。 而HIRA基因缺失則會阻止小鼠精子基因組中的核小體裝配,致使雄性原核無法形成,從而導致受精失敗[29]。 另有研究表明,HIRA基因突變雌性小鼠雖然可以正常排卵,但在與野生型雄性交配后表現為不育,且野生純合型和雜合型小鼠之間的排卵數無顯著差異[27]。 有趣的是,研究還發現絕大部分雜合子的卵母細胞受精后均能發育至囊胚階段,而沒有突變純合子的卵母細胞能夠發育至二細胞期[27]。 可見,HIRA基因在小鼠胚胎發育過程中發揮著非常關鍵的作用。

本團隊前期研究顯示,HIRA基因突變位點g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 對于小尾寒羊和魯中肉羊不同胎次產羔數均存在不同程度的影響[2,30]。 突變位點g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 分別位于HIRA基因的上游調控區和編碼區,其中g.71833755T ＞C 為錯義突變位點,該突變導致原本應該編碼谷氨酰胺的密碼子突變成了編碼精氨酸的密碼子。 本研究發現,兩個突變位點不同基因型顆粒細胞中HIRA 蛋白的表達量存在顯著差異。 g.71874104G ＞A 突變位點不同基因型顆粒細胞中,HIRA 蛋白表達量最低的為GA 型,顯著低于AA 和GG 型,但AA 和GG 型之間的表達量無顯著差異,個體水平上GA型小尾寒羊的產羔數最高,另外兩種基因型之間產羔數差異不顯著[2];g.71833755T ＞C 突變位點不同基因型顆粒細胞中,CC 型蛋白表達量最低,TC 型HIRA 蛋白表達量顯著低于TT 型,個體水平TC 型綿羊產羔數最高[2]。 在細胞培養過程中CC 型顆粒細胞的成活力極低,而顆粒細胞的增殖分化是卵泡發育的一個關鍵環節,其分泌的抑制素可作為一種旁分泌因子抑制鄰近卵泡的生長,是優勢卵泡募集的重要調節因素[31],因此顆粒細胞成活力極低很有可能會導致優勢卵泡無法募集,從而導致綿羊個體無法正常排卵,這與前期發現的CC 型綿羊個體極少一致[2]。 g.71833755T ＞C 位點受到選擇發生突變,但該突變可能與繁殖軸上某個有害突變連鎖,會影響綿羊生存狀況,在自然選擇過程中該突變被清除了。 綜上,兩個位點的突變雜合子可通過下調其在顆粒細胞中的蛋白表達促進綿羊卵泡發育、受精以及胚胎發育等過程,最終增加產羔數。

4 結論

本研究發現,g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 位點突變均導致卵巢顆粒細胞中HIRA 蛋白表達發生顯著變化,但HIRA基因mRNA 的表達均無明顯差異,且僅g.71874104G ＞A 突變位點對顆粒細胞P4和E2 的分泌有顯著影響。 推測HIRA基因的g.71874104G ＞A 和g.71833755T ＞C 兩個突變位點可能主要通過改變綿羊卵巢顆粒細胞中HIRA 蛋白表達量影響后續的受精和胚胎發育過程,最終影響綿羊的生殖能力。