TBBPA-DHEE暴露對(duì)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的影響及機(jī)制

曾政嘉, 馮偉偉, 丁陽陽, 錢顯, 羅夢(mèng)娜, 茆廣華, 仰榴青, 吳向陽

(江蘇大學(xué) 1. 環(huán)境與安全工程學(xué)院, 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 3. 化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

四溴雙酚A是全球使用最廣泛、用量最大的一種溴代阻燃劑,約18%用于生產(chǎn)衍生物[1],四溴雙酚A雙(2-羥基乙基)醚[tetrabromobisphenol A bis(2-hydroxyetyl) ether,TBBPA-DHEE]是其主要衍生物之一。TBBPA-DHEE作為一種添加型阻燃劑,廣泛用于聚苯乙烯泡沫、工程聚合物和熱塑性聚酯等材料[2],易釋放至環(huán)境中且穩(wěn)定存在。研究發(fā)現(xiàn),在各種環(huán)境介質(zhì)中可檢測(cè)到TBBPA-DHEE,包括工業(yè)廢水[3]、河流[3-4]、土壤和生物(釘螺、克氏原螯蝦、蚯蚓)[5]等樣品中。

研究發(fā)現(xiàn),四溴雙酚A具有神經(jīng)毒性[6-7],TBBPA-DHEE與其結(jié)構(gòu)高度相似,但是否具有神經(jīng)毒性有待探究。Liu等[1]采用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn),TBBPA-DHEE可破壞細(xì)胞膜的完整性,顯著抑制多巴胺分泌和乙酰膽堿酯酶活性,產(chǎn)生潛在的神經(jīng)毒性。隨后的研究中,Liu等[8]采用新生SD大鼠模型發(fā)現(xiàn),TBBPA-DHEE可改變其運(yùn)動(dòng)行為與腦神經(jīng)功能,對(duì)幼年期大鼠產(chǎn)生神經(jīng)毒性。但是,TBBPA-DHEE致神經(jīng)毒性效應(yīng)的機(jī)制尚不明確。因此,本研究以神經(jīng)細(xì)胞株——大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究TBBPA-DHEE暴露對(duì)PC12細(xì)胞的影響,并基于鈣離子信號(hào)通路探明其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

TBBPA-DHEE標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)、MTT(美國(guó)Sigma公司);DMEM、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司);GAPDH、鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)、磷酸化鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phospho-calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,p-CaMKⅡ)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(phospho-extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phospho-cAMP response element binding protein,p-CREB)抗體以及山羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司);絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)抗體(美國(guó)Novus公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司);BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channel,VGCC)ELISA試劑盒(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司);活性氧測(cè)定試劑盒、NO測(cè)定試劑盒、Ca2+含量測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所有限公司);12% SDS-PAGE超快速配制試劑盒、RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)、脫脂奶粉、5×蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);其余試劑購于國(guó)藥集團(tuán),均為分析純。

細(xì)胞培養(yǎng)用顯微鏡(日本Olympus公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(日本Panasonic公司);冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);電子天平(德國(guó)Sartorius公司);PVDF膜、垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);多功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2 TBBPA-DHEE溶液配置

稱取適量TBBPA-DHEE固體溶于溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中,分別制備濃度為2、10、20、30、40、50、60、80、100和120 mg/mL的TBBPA-DHEE儲(chǔ)備液,避光保存。為排除DMSO對(duì)細(xì)胞的影響,實(shí)驗(yàn)時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM將各濃度儲(chǔ)備液中的DMSO含量稀釋至0.05%,分別得到濃度為1、5、10、15、20、25、30、40、50和60 μg/mL TBBPA-DHEE的DMEM。

1.3 MTT法檢測(cè)TBBPA-DHEE暴露對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞,分別加入1、5、10、15、20、25、30、40、50和60 μg/mL TBBPA-DHEE行TBBPA-DHEE暴露,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和0.05% DMSO溶劑對(duì)照,培養(yǎng)箱孵育48 h;棄上清液,PBS清洗細(xì)胞2次;每孔加入100 μL MTT溶液(濃度1 mg/mL),37 ℃孵育4 h;棄上清液,加入100 μL DMSO,水平搖床緩慢振蕩15 min;于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

1.4 TBBPA-DHEE暴露實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞分組及處理 將PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM于37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。基于MTT實(shí)驗(yàn)TBBPA-DHEE半數(shù)抑制濃度(IC50)結(jié)果,將細(xì)胞分為5組:空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、5 μg/mL低劑量組、20 μg/mL中劑量組、35 μg/mL高劑量組,分別給予DMEM(10%胎牛血清)、DMEM(10%胎牛血清+0.05% DMSO)、5 μg/mL TBBPA-DHEE、20 μg/mL TBBPA-DHEE、35 μg/mL TBBPA-DHEE,孵育48 h。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和Ca2+含量測(cè)定 取“1.4.1”分組細(xì)胞,孵育48 h;于25 ℃,2 500 r/min離心10 min,收集上清液;采用試劑盒測(cè)定上清液中NO和Ca2+含量。

1.4.3 ELISA法測(cè)定細(xì)胞VGCC含量 取“1.4.1”分組細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,加入2 mL預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次;于6孔板每孔加入50 μL RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞,4 ℃振蕩30 min充分裂解;13 000×g離心5 min;取上清液,采用ELISA試劑盒檢測(cè)VGCC含量。

1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)Ca2+信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá) 取“1.4.1”分組細(xì)胞,采用RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)提取細(xì)胞蛋白,BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液將蛋白樣品定量至1 mg/mL。5組樣品各取10 μg置于12% SDS-PAGE加樣孔中,80 V電泳2 h將蛋白分離;利用半干法轉(zhuǎn)印20 min將蛋白轉(zhuǎn)印至甲醇激活的PVDF膜;PBS清洗3次,每次5 min;置于TBST稀釋的5%脫脂奶粉中封閉2 h;TBST清洗3次,每次5 min;分別置于使用1×TBST(含5%牛血清白蛋白)稀釋1 000倍的GAPDH、CaM、p-CaMKⅡThr286、p-ERK1/2Thr202/Tyr204、p-CREBSer133和MKP-1一抗(兔抗大鼠)中4 ℃孵育12～16 h;TBST清洗6次,每次5 min;置于1×TBST稀釋2 000倍的二抗(山羊抗兔)中25 ℃孵育2 h;TBST清洗6次,每次5 min;采用化學(xué)成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 TBBPA-DHEE暴露對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖1所示,與空白對(duì)照組相比,20、25、30、40、50和60 μg/mL TBBPA-DHEE組細(xì)胞抑制率顯著上升(P均<0.01),DMSO溶劑對(duì)照組和1、5、10、15 μg/mL TBBPA-DHEE組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。經(jīng)計(jì)算,TBBPA-DHEE對(duì)PC12細(xì)胞IC50為33.4 μg/mL。由此可見,TBBPA-DHEE暴露在一定濃度范圍內(nèi)(20～60 μg/mL)可顯著抑制PC12細(xì)胞活力。

* *:P<0.01,與空白對(duì)照組相比

2.2 TBBPA-DHEE暴露對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

如圖2所示,與空白對(duì)照組相比,5、20和35 μg/mL TBBPA-DHEE組細(xì)胞SOD活性和活性氧熒光強(qiáng)度均顯著上升(P均<0.01),丙二醛含量顯著升高(P<0.01或P<0.05);溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。隨著TBBPA-DHEE劑量升高,細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)。由此可見,暴露于TBBPA-DHEE可導(dǎo)致PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

2.3 TBBPA-DHEE暴露對(duì)細(xì)胞NO和Ca2+含量的影響

如圖3所示,與空白對(duì)照組相比,5、20、35 μg/mL TBBPA-DHEE組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和Ca2+含量顯著升高(P<0.01或P<0.05);溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此表明,TBBPA-DHEE可影響PC12細(xì)胞NO分泌和Ca2+轉(zhuǎn)移。

*:P<0.05,* *:P<0.01,與空白對(duì)照組相比

*:P<0.05,* *:P<0.01,與空白對(duì)照組相比

2.4 TBBPA-DHEE暴露對(duì)細(xì)胞VGCC含量的影響

如圖4所示,與空白對(duì)照組相比,5、20和35 μg/mL TBBPA-DHEE組VGCC含量均顯著下降(P<0.01);溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此表明,TBBPA-DHEE可下調(diào)膜蛋白VGCC表達(dá)。

2.5 TBBPA-DHEE暴露對(duì)細(xì)胞Ca2+信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示,與空白對(duì)照組相比,DMSO溶劑對(duì)照組所有蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),5 μg/mL TBBPA-DHEE組中CaM及MKP-1蛋白表達(dá)無顯著變化、p-CaMKⅡThr286、p-ERK1/2Thr202/Tyr204和p-CREBSer133蛋白表達(dá)顯著降低(P均<0.01),20和35 μg/mL TBBPA-DHEE組所有蛋白表達(dá)均顯著降低(P均<0.01),且20 μg/mL組蛋白表達(dá)較5 μg/mL組存在下降趨勢(shì)。由此可見,一定劑量的TBBPA-DHEE可顯著影響Ca2+信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。

* *:P<0.01,與空白對(duì)照組相比

* *:P<0.01,與空白對(duì)照組相比

3 討論

氧化應(yīng)激與各種精神、行為、情緒和認(rèn)知的異常相關(guān)[9],影響神經(jīng)突觸的可塑性[10],是引起神經(jīng)毒性的重要因素。SOD在維持氧化和抗氧化的內(nèi)部動(dòng)態(tài)平衡方面起重要作用。本研究中SOD活性上升可能是由于TBBPA-DHEE通過細(xì)胞膜擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)后,SOD自動(dòng)激活以減輕氧化應(yīng)激所導(dǎo)致,而未耗盡的活性自由基會(huì)繼續(xù)損害抗氧化防御系統(tǒng)。徐彤等[2]將斑馬魚暴露于TBBPA-DHEE后,其SOD活性同樣呈上升趨勢(shì),表明TBBPA-DHEE可引起生物體發(fā)生氧化失衡。丙二醛是氧化應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可作為衡量脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)[11]。Zhang等[11]將L02正常肝細(xì)胞暴露于四溴雙酚A(TBBPA)后,丙二醛含量顯著上升,表明細(xì)胞受到活性氧影響發(fā)生脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞膜受損。研究表明,溴代阻燃劑可引起嚴(yán)重的體外氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致活性氧生成、細(xì)胞凋亡和壞死[12]。Liu等[1]研究發(fā)現(xiàn),TBBPA-DHEE暴露可顯著增加PC12細(xì)胞活性氧生成。本研究發(fā)現(xiàn),TBBPA-DHEE暴露能夠產(chǎn)生與TBBPA暴露相似的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致氧化損傷。NO是大腦發(fā)育的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,可通過調(diào)節(jié)突觸可塑性和腦血流量從而影響記憶能力[13]。Suh等[14]研究發(fā)現(xiàn),TBBPA暴露可顯著升高大鼠胰腺β細(xì)胞中NO水平,加重炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TBBPA-DHEE顯著促進(jìn)NO分泌,由此表明,TBBPA-DHEE和TBBPA暴露對(duì)NO具有相似的毒性效應(yīng),可影響細(xì)胞信息傳遞及突觸可塑性,產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

VGCC作為一種高分子復(fù)合蛋白,是神經(jīng)系統(tǒng)中電信號(hào)和許多重要細(xì)胞過程之間的橋梁,介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流以響應(yīng)質(zhì)膜去極化[15]。已證明溴代阻燃劑可抑制VGCC表達(dá),從而減少Ca2+流入細(xì)胞并減少神經(jīng)遞質(zhì)分泌[16]。本研究結(jié)果顯示,TBBPA-DHEE誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)液中Ca2+含量上升和VGCC表達(dá)下調(diào),抑制Ca2+內(nèi)流進(jìn)入胞內(nèi),與Hendriks等[16]研究毒性效應(yīng)一致,表明誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性部分原因是TBBPA-DHEE可誘導(dǎo)VGCC表達(dá)降低和破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)。

CaM是鈣信號(hào)的反應(yīng)蛋白,介導(dǎo)Ca2+誘發(fā)反應(yīng),能與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+結(jié)合,是Ca2+的關(guān)鍵傳感器。CaM表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達(dá)、突觸可塑性等功能受影響[17]。MKP-1控制著許多炎癥基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),在神經(jīng)退行性疾病中起著神經(jīng)保護(hù)作用,可通過調(diào)節(jié)線粒體功能、氧化應(yīng)激和自噬從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡[18]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn),MKP-1缺失對(duì)神經(jīng)發(fā)生有抑制作用,并可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)干細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬。CaMKⅡ在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)水平高,可被自磷酸化作用廣泛調(diào)節(jié),單個(gè)蘇氨酸殘基的快速自磷酸化可使其催化亞基中的催化單元保持活性[19]。Dingemans等[19]研究發(fā)現(xiàn),溴代阻燃劑暴露可顯著降低小鼠海馬中p-CaMKⅡThr286水平,誘導(dǎo)神經(jīng)元活性下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TBBPA-DHEE同樣下調(diào)p-CaMKⅡThr286水平,與溴代阻燃劑存在類似的毒性效應(yīng)。Strack等[20]研究發(fā)現(xiàn),TBBPA暴露可顯著降低正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E p-ERK水平;Kim等[21]將雄性小鼠暴露于TBBPA后,海馬中p-CREB水平顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn),TBBPA-DHEE暴露誘導(dǎo)p-CaMKⅡThr286、p-ERK1/2Thr202/Tyr204和p-CREBSer133蛋白下調(diào),與TBBPA的調(diào)控作用相同;因此,TBBPA-DHEE對(duì)Ca2+信號(hào)通路中的部分蛋白具有類似于TBBPA的毒性效應(yīng)。

由此可見,TBBPA-DHEE暴露可顯著下調(diào)PC12細(xì)胞Ca2+信號(hào)通路從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性,如圖6所示,PC12細(xì)胞經(jīng)TBBPA-DHEE暴露后,抑制VGCC蛋白表達(dá),導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減少,致CaM、MKP-1、p-CaMKⅡThr286、p-ERK1/2Thr202/Tyr204和p-CREBSer133表達(dá)降低。

圖6 TBBPA-DHEE下調(diào)鈣離子信號(hào)通路相關(guān)蛋白

綜上所述,TBBPA-DHEE具有與TBBPA相似的毒性效應(yīng),其可顯著抑制PC12細(xì)胞活力并導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷,其可能通過下調(diào)VGCC表達(dá),影響細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài),進(jìn)而影響Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。