外泌體在多囊卵巢綜合征中的研究進展

陳雯, 連方, 辛欣, 于辰, 梁啟惠, 吳海萃

(1. 山東中醫藥大學第一臨床醫學院,山東 濟南 250011; 2. 山東中醫藥大學附屬醫院生殖與遺傳科,山東 濟南 250014)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種常見的女性內分泌疾病,其臨床癥狀具有高度異質性,以月經不調、高雄激素血癥、代謝異常、生殖障礙為主要臨床表現。研究表明,PCOS患者患有2型糖尿病、心血管疾病、子宮內膜癌等疾病的概率大大增加,PCOS發病機制與排卵障礙、高雄激素血癥、胰島素抵抗、肥胖等因素綜合作用相關[1]。外泌體作為天然的通訊分子,是細胞分泌的一種細胞外囊泡,外泌體及其內容物是細胞間信號傳遞的重要載體。近年來,隨著外泌體研究領域的深入,大量研究表明外泌體及其內含物在包括PCOS在內的多種生殖、內分泌及代謝疾病的發生發展過程中發揮重要作用[2]。目前PCOS外泌體的研究主要集中在卵泡發育、內分泌及代謝異常、炎癥反應等方面。本文主要闡述外泌體在PCOS中的作用及治療價值,探討外泌體在PCOS中的發生發展機制。

1 外泌體概述

外泌體是一種幾乎可由所有細胞分泌的納米級膜性囊泡,直徑為30～150 nm,其主要成分包括表面磷脂雙分子層及其攜帶的內容物(核酸、蛋白質、脂質、氨基酸和代謝物等)。外泌體包含的特異性生物分子決定了外泌體的功能,在癌癥、代謝性疾病、心腦血管疾病以及神經退行性疾病等多個領域,主要發揮調控細胞間信息傳遞、免疫反應以及修復調節作用[3],尤其在介導癌癥的進展與轉移、早期診斷和治療方面的研究更深入。Giovannelli等[4]研究報道,前列腺癌細胞通過釋放外泌體直接作用于基質或前列腺癌上皮細胞,進行細胞交流。Wortzel等[5]研究發現,存在于原發性腫瘤細胞和遠處器官微環境之間的外泌體通過介導細胞間通訊,在促進轉移前局部腫瘤微環境(轉移生態位)的形成和腫瘤轉移方面發揮重要作用。Li等[6]研究顯示,在免疫完整小鼠中傳遞腫瘤細胞來源的外泌體miR-155-5p可抑制卵巢癌的進展和巨噬細胞的浸潤,并激活CD8+T細胞功能,產生免疫反應。此外,受細胞來源以及內容物的影響,外泌體的功能具有高度異質性,其中間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)來源的外泌體已被認為是一種新的組織損傷治療方法,在血管生成、組織修復與再生、免疫調節、抵抗炎癥方面發揮重要作用[7]。

基于獨特的生物相容性、較好的穩定性和對細胞的高親和力,外泌體被視為化學藥物、RNA以及蛋白質等藥物分子的最佳載體[8],在防止運載的藥物分子分解、靶向受體細胞、提高藥物利用率方面發揮優勢作用。據Lou等[9]報道,miR-199a-3p修飾的脂肪來源的間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells,AMSC)外泌體可以通過靶向雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路提高肝細胞癌細胞對化療藥物的敏感性,一定程度上解決了體內miR-199a-3p分子直接給藥易降解的問題。Kamerkar等[10]研究證實,基因工程改造后的外泌體,攜帶特異性靶向致癌基因KrasG12D的RNA,能夠促進胰腺癌中致癌基因KRAS的靶向治療作用,在多種胰腺癌小鼠模型中表現出良好的療效。

2 外泌體在PCOS發生發展中的作用

基于脂質雙分子結構、豐富的內容物以及穿梭于細胞的能力,外泌體在包括生殖、配子發生、胚胎發生和分化在內的各種生理和病理過程中發揮重要作用[11]。外泌體幾乎可以由所有種類的細胞分泌到細胞外環境中,并已在PCOS患者體液中檢測到。然而外泌體來源細胞及其攜帶的生物活性分子決定了外泌體功能的異質性。2019年Wang等[12]對卵泡液來源的外泌體進行生物信息學分析,發現有167個上調的環狀RNA(circRNA)和245個下調的circRNA,可能靶向與細菌感染、慢性炎癥和氧化應激相關的途徑,并構建了circRNA-miRNA相互作用網絡。2020年Wang等[13]通過高通量測序技術在PCOS患者的卵泡液中鑒定出1253個上調的長鏈非編碼RNA(lncRNA)和613個下調的lncRNA,可能參與胞吞、河馬信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型(human T-cell lymphotropic virus types Ⅰ,HTLV-1)感染相關的途徑,其中CRK、CDC25B、AKT2、ELK4和TGFBR1基因以高富集分數顯示其與MAPK信號通路的可能聯系。Zhou等[14]通過微列陣分析卵泡液外泌體,構建了lncRNA、miRNA和6個PCOS相關基因(IRS1、CYP11A1、BMP6、FSHR、WNT4和CYP19A1)的調控網絡,與Wang等[13]的研究結果一致,其中差異表達的RNA主要作用于MAPK信號通路和一些炎癥相關信號通路。已有研究表明[15],MAPK信號通路協調細胞增殖、分化、生長及凋亡過程,在調控卵泡發育中起重要作用,這正是PCOS的主要發病機制之一。最近Bai等[16]基于卵泡液外泌體中lncRNA和顆粒細胞中miRNA、信使RNA(mRNA)構建了外泌體lncRNA驅動的PCOS的內源競爭RNA(ceRNA)網絡,該網絡顯示主要富集于腫瘤壞死因子信號通路、過氧化物酶體增殖激活受體信號通路、脂肪酸代謝和晝夜節律等。

在PCOS患者血漿外泌體的研究中,Jiang等[17]發現了5種差異表達的miRNA,包括miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-20b-5p、miR-106a-5p和miR-18a-3p,與月經周期、竇卵泡計數和激素水平相關。Zhang等[18]報道,PCOS患者血清外泌體中miR-1299、miR-6818-5p、miR-192-5p和miR-145-5p顯著差異表達,并將這些miRNA鑒定為潛在的生物標志物。近期王宏鋒等[19]首次從血漿外泌體角度研究PCOS相關的差異蛋白質組,篩選出16個PCOS相關的差異蛋白,包括4個表達上調和12個表達下調的蛋白,其中妊娠帶蛋白(PZP)和甘露糖結合凝集素2(MBL2)有可能成為研究PCOS的新靶點。這表明PCOS中外泌體的差異性表達不是偶然現象,外泌體及其內容物可能在驅動PCOS發病機制中發揮一定的作用。

2.1 卵泡液外泌體調控卵巢顆粒細胞及卵丘細胞影響卵泡發育

盡管PCOS的病因和發病機制尚不明確,但卵泡發育異常誘導無排卵是PCOS的基本特征。卵泡液為卵泡發育和卵母細胞成熟提供重要的微環境。Hu等[20]研究表明,PCOS患者與對照組卵泡液外泌體內容物的表達存在顯著差異,可能主要參與甘氨酸、絲氨酸和糖胺聚糖的生物合成以及蘇氨酸代謝過程。近期的幾項研究提示[21-25],卵泡液外泌體可能通過調控卵巢顆粒細胞和卵丘細胞影響卵泡發育。卵巢顆粒細胞是構成卵泡的重要組分,為卵子提供營養和傳遞信息,是卵泡發育的關鍵。Li等[21]發現PCOS中卵泡液外泌體蛋白質組學特征的改變,與炎癥過程、活性氧代謝過程、細胞遷移和增殖有關,并且證明富含S100鈣結合蛋白A9(S100-A9)的外泌體通過激活核因子κB(NF-κB)信號傳導途徑,顯著加重炎癥并破壞類固醇生成,在卵巢顆粒細胞功能的調節中起重要作用。Yuan等[22]研究發現,miR-424-5p在PCOS患者卵泡液外泌體中差異性表達且通過阻斷細胞分裂周期相關蛋白4(cell division cycle associated 4,CDCA4)介導的Rb/E2F1信號通路,抑制卵巢顆粒細胞增殖并誘導卵巢顆粒細胞衰老。Zhao等[23]報道PCOS中卵泡液外泌體miR-143-3p通過靶向人骨形態發生蛋白受體-1A(recombinant bone morphogenetic protein receptor 1A,BMPR1A)并阻斷Smad1/5/8信號通路,促進卵巢顆粒細胞凋亡。因此,PCOS中卵泡液外泌體miRNA通過影響卵巢顆粒細胞的生物學功能,可能在PCOS卵泡發育中發揮重要作用。在卵泡發育早期,卵母細胞與周圍卵丘細胞表現出相互依賴的關系,其中卵丘細胞主要負責分泌生長激素和卵巢類固醇激素,在卵母細胞發育中起重要作用。Zhao等[24]研究表明,MSC衍生的外泌體miR-323-3p通過靶向PCOS中的程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death 4, PDCD4)促進細胞增殖并抑制卵丘細胞凋亡。此外,Wang等[25]研究證實在PCOS患者卵丘細胞中miR-323-3p的表達水平下調,其中下調的miR-323-3p通過靶向胰島素樣生長因子1調節PCOS中的類固醇生成和細胞凋亡,miR-323-3p可能是改善PCOS中卵丘細胞功能障礙的一個新的、有前途的分子靶點。因此,卵泡液來源的外泌體極有可能作為調控卵泡發育的新分子參與到PCOS的發生發展中。

2.2 外泌體介導細胞色素P450酶合成影響激素水平

高雄激素血癥是PCOS的主要臨床癥狀,表現為肥胖、多毛和脫發等。細胞色素P450酶包括CYP17、CYP21、CYP19和CYP11A,是類固醇激素生物合成途徑中的關鍵酶。Chaudhary等[26]對PCOS患者卵巢膜細胞的研究表明,卵巢類固醇生成增加,雄激素產生增加,主要歸因于類固醇激素生物合成途徑中關鍵酶細胞色素P450酶的表達改變,其中CYP11A基因作為可能的遺傳生物標志物在PCOS的發病機制中起主要作用。Yu等[27]報道了PCOS患者卵泡液外泌體中參與類固醇合成途徑的核心酶mRNA水平,其中CYP11A、CYP19A和HSD17B2表達水平增加,同時伴隨著卵泡液中激素水平的變化,PCOS患者卵泡液中雌三醇(P<0.01)、雌二醇(P<0.05)和異戊烯醇酮(P<0.01)水平顯著升高,孕酮水平降低(P<0.05),這表明外泌體中mRNA的表達與卵泡液中激素水平的改變相關,卵泡液中差異表達的mRNA誘導類固醇生成異常,是PCOS患者卵泡液中雌激素和孕烯醇酮升高的潛在機制。然而由于研究者沒有對卵泡液中的類固醇進行全面分析,故其表達水平與雄激素之間的關系還需進一步研究。Huang等[28]研究揭示了PCOS中卵泡液外泌體circLDLR的ceRNA網絡,circLDLR的減少能夠增加miR-1294的表達,抑制受體細胞中CYP19A1的表達,并減少其雌激素的分泌。目前有關PCOS外泌體與高雄激素血癥的研究并不多,未來仍需在不同的隊列中進一步研究。

2.3 外泌體調控胰島素通路和肝臟代謝影響胰島素抵抗

胰島素抵抗在PCOS患者中普遍存在,且與其生殖和代謝并發癥密切相關。Sun等[29]研究表明,人體MSC衍生的外泌體可以通過逆轉外周胰島素抵抗和減輕β細胞破壞來緩解2型糖尿病。肝臟是提供免疫和代謝功能的最大代謝器官,其中肝臟異位脂質積累作為可能影響PCOS代謝綜合征的因素之一受到關注[30]。盡管近年對肝臟脂肪沉積與肝胰島素抵抗之間的因果關系爭論較多,但兩者的相關性毋庸置疑。Gao等[31]對PCOS不同年齡階段小鼠肝組織與肝外泌體進行研究,顯示肝組織與外泌體之間的復雜代謝作用,其中糖酵解和三羧酸循環的下調可能與PCOS的肝臟病理生理機制有關,與年齡無關。在脫氫表雄酮誘導的PCOS大鼠模型中,Cao等[32]報道了AMSC及其衍生的外泌體可以部分由miR-21-5p介導,通過靶向B細胞易位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)調節肝臟葡萄糖穩態,顯著減輕PCOS大鼠中包括代謝異常、多囊卵巢和不孕的多種表型。Ye等[33]對PCOS患者外泌體進行轉錄組學和代謝組學聯合分析,發現β-生育酚、1-甲基乙內酰脲、2-異丙基蘋果酸、全反式-4-羥基維甲酸和亞麻酸這5種差異代謝物可能參與PCOS的發病機制;而miRNA測序結果顯示,差異miRNA主要調節代謝途徑,因此推測miR-196a-3p,miR-143-5p,miR-106a-3p,miR-34a-5p和miR-20a-5p可能調節這5個差異代謝物,并且是診斷PCOS的潛在生物標志物。以上研究表明,外泌體可以通過調節基因表達來調節器官間外周組織包括肝臟以及脂肪組織的代謝過程,從而影響胰島素抵抗,進而介導PCOS的發生發展。

2.4 外泌體調控糖脂代謝影響肥胖

PCOS通常與肥胖有關,損害生殖健康,高糖高脂肪飲食是導致肥胖的原因之一。給予來曲唑誘導PCOS小鼠高脂肪、高糖飲食一段時間后,治療組小鼠和對照組小鼠均出現嚴重的代謝失調和生殖障礙[34]。脂肪組織過度堆積是肥胖最突出的特征,Zhou等[35]報道在排除食物攝入影響下,年輕健康小鼠棕色脂肪組織來源的外泌體可減輕高脂飲食誘導肥胖小鼠的體重、降低血糖并減輕脂質積累等代謝綜合征。Hong等[36]研究表明,在具有胰島素抵抗的PCOS小鼠模型中,血清外泌體中miR-20b-5p和miR-106a-5p的過表達可以減輕脂肪細胞分化,從而減輕胰島素抵抗引起的PCOS發病過程中的脂質代謝障礙。據Katayama等[37]報道,miR-20b-5p可以通過蛋白激酶B(Akt)信號通路傳導調節胰島素刺激的葡萄糖代謝從而發揮細胞內作用,不僅被認為是與2型糖尿病相關的生物標志物,而且是調控糖脂代謝的新分子。綜上,外泌體通過介導糖脂代謝過程影響肥胖,初步揭示了外泌體在調控PCOS脂質代謝障礙中的重要作用。

3 外泌體在PCOS中的治療價值

鑒于PCOS臨床癥狀的高度異質性,目前其治療方案需要依據患者的需要個體化制訂,除了改善生活方式和減重之外,藥物治療也以癥狀為導向進行針對性用藥,尚沒有特效藥發揮顯著治療效果。基于外泌體載藥的優勢及其功能特點,外泌體及其差異表達的內容物已經在治療PCOS卵泡發育、代謝異常以及緩解炎癥方面發揮優勢作用。Zhou等[38]的研究證明由卵泡液衍生的外泌體產生的miR-18b-5p可降低磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表達并促進磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR信號通路的激活,從而改善PCOS。Cao等[39]報道卵泡液來源的外泌體miR-143-3p/miR-155-5p可以通過調節PCOS中卵巢顆粒細胞的糖酵解來調節卵泡發育不良。此外,特別是MSC衍生的外泌體,作為一種治療PCOS引起的不孕癥的新方法,越來越受到關注。Zhao等[40]報道了人臍帶MSC衍生的外泌體可以抑制PCOS中的NF-κB信號傳導,從而減少卵巢顆粒細胞的炎癥反應,并增加抗炎因子IL-10的表達。同時,它們還能抑制促炎因子腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ的表達,發揮抑制細胞凋亡和促進孕酮生成的作用。

本文總結了近年來外泌體在PCOS中的研究,對PCOS外泌體差異表達的分子及其功能(表1)和外泌體對PCOS的治療作用(表2)進行歸納。

表1 PCOS外泌體中差異表達的分子及其功能

表2 外泌體對PCOS的治療作用

4 小結與展望

攜帶多種分子的外泌體作為細胞間交流的重要載體,通過介導卵泡發育、調節激素水平、胰島素抵抗、肥胖與代謝障礙,參與PCOS的發生發展過程。通過對外泌體的蛋白質或核酸譜的變化進行分析,選取其特異表達的分子作為PCOS診斷和預后的生物標志物,有望成為PCOS早期診斷和治療監測的新方式。此外,依據細胞來源研究外泌體及其內容物的治療作用,對外泌體作用于PCOS的相關因子、作用通路進行分析,有助于進一步探索PCOS的發病機制,輔之以生物工程技術對外泌體進行改造,外泌體有望作為載體運送化學藥物、RNA、蛋白質,未來可能實現對PCOS的靶向治療,從而緩解PCOS患者內分泌以及代謝異常,達到治療PCOS引起的不孕癥的目的。然而外泌體的研究尚處于起步階段,大規模生產和儲存存在困難,目前尚沒有用于外泌體分離和分析的標準化方法,但相信隨著外泌體生物工程研究的深入,以及各種新興技術探索其生化和物理化學特性,外泌體在醫療實踐中的大規模應用將得到進一步發展,進而對PCOS的研究及其診斷與治療提供新的思路。