低溫脅迫對小粒種咖啡幼苗生理特性的影響

黃麗芳， 龍宇宙， 李金芹， 董云萍， 王曉陽， 陳鵬，王憲文， 閆林.2*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點實驗室，海南 萬寧 571533； 2.海南省Sim Soonliang院士工作站，海南 萬寧 571533； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099； 4. 保山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 保山 678000）

咖啡是茜草科(Rubiaceae)多年生常綠灌木或小喬木，主要栽培的有小粒種咖啡（Coffea arabica）、中粒種咖啡（Coffea robusta）和大粒種咖啡（Coffea liberica），咖啡作為世界三大飲料作物之首，其經(jīng)濟價值日益提高[1-2]。小粒種咖啡主要種植于云南，面積約12 萬hm2，占全國總面積的98%，產(chǎn)量居世界第13 位，咖啡已成為云南省第4大出口農(nóng)產(chǎn)品，在助力脫貧攻堅、鄉(xiāng)村振興及服務(wù)國家“一帶一路”倡議中發(fā)揮重要作用[3-4]。

作為我國咖啡主產(chǎn)區(qū)的云南省，冬季常有霜害和寒流等低溫危害。當月平均溫度降至12.7 ℃時，小粒種咖啡植株出現(xiàn)生長緩慢的現(xiàn)象；當溫度降至2～-1 ℃時咖啡樹整株受害，尚未投產(chǎn)的咖啡幼樹植株頂梢、側(cè)梢枯死，寒害嚴重的導(dǎo)致整株死亡，造成較大的經(jīng)濟損失[5]。我國熱區(qū)土地面積小，適宜種植咖啡的區(qū)域有限，且由于中國緯度偏高，極端天氣的頻發(fā)也容易給咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來破壞性影響[6]。因此，培育和篩選抗寒性較高的咖啡品種是中國咖啡育種的重要目標，開展咖啡抗寒性探究可以加快咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國外學(xué)者從抗氧化系統(tǒng)的生物學(xué)特性及礦物質(zhì)含量的變化上分析鑒定不同基因型咖啡的抗寒性[7-9]。我國學(xué)者早期采取田間自然鑒定方法篩選抗寒種質(zhì)，從種植地的選擇、栽培管理措施等方面進行咖啡的防寒御寒研究[5,10-11]。近期的研究主要集中在低溫對不同基因型及不同嫁接方式的咖啡葉綠素熒光、光合參數(shù)的影響[12-13]。

‘卡蒂姆CIFC7963'是葡萄牙國際咖啡銹病研究中心用時20 年選育出的卡蒂姆品種的優(yōu)良世代（F6），該品種適應(yīng)性廣、較耐寒耐旱、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性強，在生產(chǎn)上大面積推廣，占云南咖啡生產(chǎn)面積的80%以上，是云南省咖啡生產(chǎn)的主栽品種[14]。本研究通過探究小粒種咖啡‘卡蒂姆CIFC7963'在低溫脅迫下的抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及細胞膜透性等，了解咖啡防御低溫傷害的機制，為抗寒性咖啡種質(zhì)資源的篩選奠定基礎(chǔ)，同時為進一步研究咖啡抗寒機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小粒種咖啡‘卡蒂姆CIFC7963'1年生實生苗來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃，材料統(tǒng)一栽植在泥炭土和沙土混合基質(zhì)的塑料盆中，選取生長正常、無病蟲害和機械損傷的苗木放入人工培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫處理 試驗共設(shè)4 個溫度梯度，分別為8、4、0、-2 ℃；光照強度為1萬 lx，光周期為晝夜12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。分別在低溫脅迫0、12、24、36、48 h 時采集葉片迅速置于液氮中冷凍，-80 ℃保存，用于測定葉片生理生化指標；采集新鮮葉片立即進行電導(dǎo)率的測定。0 h設(shè)為對照（CK），各處理3次重復(fù)，每重復(fù)5株。

1.2.2 指標測定 采用南京建成生物技術(shù)研究所測定試劑盒分別測定葉片的過氧化物酶（peroxidase，POD）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及脯氨酸（proline，Pro）、可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，具體操作參照說明書，每個處理測定3次重復(fù)，每重復(fù)5株。

1.2.3 相對電導(dǎo)率測定 隨機選擇處理后的葉片，避開主葉脈剪成長寬均為0.2 cm的碎片，稱取0.2 g碎片加入20 mL去離子水，抽真空，放入三角瓶中并蓋上封口膜，在室溫下振蕩8 h，振蕩頻率80 r·h-1。采用雷磁DDS-307A 電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測定浸泡液的電導(dǎo)率（R1），再將盛有浸泡液的三角瓶置于沸水浴30 min，冷卻至室溫，然后測定浸泡液的電導(dǎo)率（R2），3次重復(fù)。相對電導(dǎo)率按以下公式計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對小粒種咖啡滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

低溫脅迫會影響小粒種咖啡的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，如脯氨酸（Pro）、可溶性糖、可溶性蛋白含量等，植物利用滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓和冰點，從而達到抵抗低溫對植株的影響。從圖1 可以看出，8 ℃低溫脅迫時，小粒種咖啡葉片的Pro 含量隨脅迫時間延長呈持續(xù)上升的狀態(tài)，在4、-2和0 ℃低溫脅迫時呈先升后降的趨勢；Pro含量在8、4、0、-2 ℃脅迫48 h 時，與0 h 相比均差異顯著（P＜0.05）。從4 個脅迫處理來看，0 ℃時小粒種咖啡葉片的Pro 含量相對增幅較高，-2 ℃時的相對增幅較低。

圖1 不同處理下咖啡葉片的脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量Fig. 1 Proline， soluble protein and soluble sugar contents in coffee leaves under different treatments

在低溫處理過程中，可溶性蛋白含量隨著脅迫時間的延長在8、4 ℃處理呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，0和-2 ℃處理則先上升后下降，0 ℃處理24 h、-2 ℃處理36 h 后可溶性蛋白含量受抑制，呈下降趨勢。8、0 和-2 ℃低溫脅迫處理組與0 h 差異均顯著（P＜0.05）。

可溶性糖含量與Pro、可溶性蛋白在不同低溫脅迫下的變化趨勢不同。低溫脅迫后，咖啡自身積累大量可溶性糖來阻止組織受寒害，因此可溶性糖含量均比0 h顯著增加（P＜0.05）。8、4、0、-2 ℃低溫脅迫48 h 時，小粒種咖啡葉片的可溶性糖含量比0 h 時分別增長了0.94、1.14、1.05、0.18 倍。8 ℃處理時，可溶性糖含量呈逐漸上升的趨勢；4、0、-2 ℃處理時，可溶性糖含量先上升后下降，可溶性糖含量在-2 ℃處理36與48 h無顯著變化。

2.2 低溫脅迫對小粒種咖啡抗氧化酶活性的影響

由圖2 可知，隨著低溫脅迫時間的延長，小粒種咖啡總超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同溫度處理下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。8 ℃處理時，SOD 活性呈一直上升的趨勢，處理48 h 比0 h時增長42.86%，差異顯著（P＜0.05）；4、0 和-2 ℃處理時，SOD 活性先上升后下降，4 ℃處理在36 h達到峰值，0 和-2 ℃處理均在24 h 時達到最大值，分別比0 h 時增加了65.08%、42.06%、49.21%，0 和-2 ℃處理48 h 時的酶活性與0 h 差異不顯著。

圖2 不同處理下咖啡葉片總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性Fig. 2 SOD， CAT and POD activities in coffee leaves under different treatments

過氧化氫酶（CAT）活性與SOD 活性變化趨勢相似，CAT活性在4個溫度處理48 h時均顯著高于0 h時（P＜0.05）。8 ℃處理48 h時，CAT活性顯著高于其他處理，比CK高出118.88%；4、0和-2 ℃處理均在24 h 時達峰值，分別比0 h 時顯著提高了121.88%、98.70%和184.11%，隨后活性逐漸下降，說明隨著小粒種咖啡葉片內(nèi)H2O2含量增加，CAT清除能力減弱，組織內(nèi)的過氧化程度加重造成寒害。

過氧化物酶（POD）活性的總體變化趨勢是先上升后降低，0 ℃低溫處理組與0 h 均差異顯著（P＜0.05），36 h 的POD 活性最高，為0.87 U·mg-1，是對照的2.9 倍。8、4 和-2 ℃在低溫處理24 h 時達到0.67、0.61、0.98 U·mg-1，與0 h 時相比，差異顯著（P＜0.05）；但處理48 h 時與0 h 時差異均不顯著。

2.3 低溫脅迫對小粒種咖啡丙二醛含量和相對電導(dǎo)率的影響

不同低溫脅迫下，丙二醛（MDA）含量均隨脅迫時間延長呈逐漸升高的趨勢（圖3）。8和4 ℃處理MDA 含量維持在較低水平，最高不超過99 .00 nmol·g-1。0 和-2 ℃處理48 h 時MDA 含量較0 h顯著增加，分別為132.00和124.58 nmol·g-1。4 個溫度處理48 h 時較0 h 分別增加0.73、0.68、1.32、1.19倍。

相對電導(dǎo)率和MDA 含量動態(tài)變化規(guī)律相似（圖3）。8 ℃處理組與0 h 均無顯著差異，相對電導(dǎo)率在30%～40%之間；4 和-2 ℃處理，在脅迫24、36、48 h 時相對電導(dǎo)率較0 h 顯著增加；4、0 和-2 ℃處理，在脅迫48 h 時相對電導(dǎo)率為84.69%、91.29%和98.35%，是0 h 的2.65、2.86 和3.08 倍，說明咖啡葉片細胞質(zhì)膜透性增大，細胞內(nèi)含物外滲，咖啡植株受寒害嚴重。

圖3 不同處理下咖啡葉片丙二醛和相對電導(dǎo)率的含量Fig. 3 MDA and relative conductivity of coffee leaves under different treatments

2.4 各抗寒指標間的相關(guān)性分析

表1 的相關(guān)性分析表明，POD 活性與CAT 活性、相對電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與可溶性蛋白含量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；SOD 與CAT、可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；CAT 與Pro、可溶性糖、相對電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Pro 與可溶性糖、MDA 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；MDA 含量與相對電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表1 各抗寒性指標間的相關(guān)性分析Table 1 Analysis of correlation of indexes for cold resistance

2.5 咖啡單項指標主成分分析

對咖啡8個生理指標進行主成分分析（表2），主因子分析過程相應(yīng)提取了A1、A2、A3 3 個主成分量，即前3 個因子對總方差的貢獻最大。A1、A2、A3的特征值分別為2.70、1.72、1.30，貢獻率分別為33.69%、21.48%、16.28%，累積貢獻率占總方差的71.45%。A1 在CAT、Pro 和可溶性糖含量上有較高載荷量，A2 在MDA 和相對電導(dǎo)率上有較高載荷量，A3 在可溶性蛋白含量上有較高載荷量。

表2 各綜合指標的系數(shù)及貢獻率Table 2 Coefficients and contribution rates of various comprehensive indicators

3 討論

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的主要成分，在植物抵抗低溫脅迫時能平衡細胞代謝、促進蛋白質(zhì)水合。羅新義等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下游離脯氨酸含量增加，植物抗寒性增強；可溶性蛋白是植物光合作用的產(chǎn)物，用于蔗糖合成、維持植物代謝等[16-17]。利容千等[18]研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件下，植物代謝反應(yīng)減弱，水解作用增強，合成作用減小，可溶性蛋白等大分子化合物降解為氨基酸、可溶性糖和肽等物質(zhì)；受低溫脅迫后植物體內(nèi)可溶性糖含量的增加可以降低細胞質(zhì)的冰點，增強流動性，防止細胞脫水及蛋白質(zhì)變性，起到防脫水的作用[19]。本研究中，小粒種咖啡在低溫脅迫后脯氨酸（Pro）、可溶性糖和可溶性蛋白含量均不同程度升高，這與在螺旋藻[20]、冬小麥[21]等植物上的研究結(jié)果相似。在低溫條件下，滲透物質(zhì)含量的增加會使植株的抗寒性得到提升[22]。小粒種咖啡葉片Pro含量和可溶性糖含量處理組較對照有所增加；可溶性蛋白含量隨著低溫處理時間的延長，先降低后增加，在0 ℃處理36 h 和-2 ℃處理48 h時可溶性蛋白含量略受抑制，說明在低溫脅迫過程中可溶性蛋白含量水解成糖類物質(zhì)來維持小粒種咖啡葉片細胞的生理功能。

抗氧化酶活性變化是判斷植物在低溫脅迫環(huán)境中生理機能的重要指標[23]，植物在低溫脅迫下產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，從而造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，POD、SOD和CAT作為植物體內(nèi)的保護酶，可通過其協(xié)同作用來保護細胞膜[24]。研究表明，SOD 將O2-歧化成H2O2，再由POD 和CAT 等酶來完成清除，從而緩解活性氧和自由基帶來的侵害[25]，使植株在一定程度上忍耐和抵御低溫[26]。本研究在經(jīng)過4 個低溫脅迫處理后，葉片的POD、SOD 和CAT 活性大致呈先升后降的趨勢，這與王玲麗等[27]的研究結(jié)果相似，表明低溫脅迫誘導(dǎo)了小粒種咖啡植株體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的增強從而提高自身清除活性氧和自由基的能力，以減輕低溫對細胞膜的傷害；隨著溫度的降低和處理時間的延長，抗氧化酶活性受到抑制呈不同程度下降[28]。

細胞膜系統(tǒng)是生命有機體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，是植物細胞內(nèi)外環(huán)境之間的一個界面，既能接受和傳遞信息，又能對環(huán)境脅迫做出反應(yīng)[29]，當植物遭受到低溫脅迫時透性增加導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率變大，細胞膜嚴重受損[30-31]；丙二醛是低溫脅迫后積累的自由基和活性氧等過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的終端物質(zhì)，會損害細胞膜的結(jié)構(gòu)以及功能，與細胞受損程度呈正相關(guān)，與抗寒性呈負相關(guān)[32]。本研究中，在低溫脅迫過程中，MDA 含量和相對電導(dǎo)率均呈不同幅度的增加，8 和4 ℃處理MDA 含量增加緩慢，咖啡幼苗對外界逆境的刺激反應(yīng)能做出較好地調(diào)節(jié)，維持系統(tǒng)平衡，0 和-2 ℃處理MDA 含量和相對電導(dǎo)率急劇增加，說明細胞膜受到損傷，咖啡葉片細胞氧化程度較大，葉片受害嚴重，這與烤煙[33]和葡萄[34]中的研究結(jié)果相似。

綜上所述，小粒種咖啡Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD和CAT活性在8 ℃處理時呈平穩(wěn)上升的趨勢，在4、0、-2 ℃處理時基本都先升后降；隨著溫度的降低和處理時間的延長，POD 活性也先升高后降低。MDA 含量和相對電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，變化趨勢也相似，2 個指標都是隨著溫度降低逐漸增加。植物對低溫脅迫的響應(yīng)是復(fù)雜的生理生化和能量代謝變化過程，通過觀察和測定不同低溫脅迫下小粒種咖啡1 年實生苗‘卡蒂姆CIFC7963'葉片中的滲透物質(zhì)含量、抗氧化酶活性、MDA 含量和相對電導(dǎo)率的變化，了解了各指標的變化規(guī)律及各指標間的相關(guān)性，為咖啡抗寒品種的選育奠定基礎(chǔ)，后續(xù)還將在分子層面進行更深入研究。