黑老虎新品系的SSR指紋圖譜構建

鄒建文　饒紅欣　陳靈　羅先權　何潤華　陳銘　何艷

關鍵詞：黑老虎；DNA 指紋圖譜；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號：S567.19 文獻標識碼：A

黑老虎（Kadsura coccinea）俗稱冷飯團，為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬一種常綠木質藤本植物。黑老虎是一種食藥兼用的新型珍稀水果，具有較高的藥用價值和營養保健功效，而且其果形奇特、果期長，亦具有獨特的觀賞價值，在中藥材、水果和食品以及園林綠化美化等方面頗具發展潛力[1]。近年來，隨著其果實和相關產品在國內市場不斷走俏，黑老虎在湖南、廣西、貴州和云南等省（區）得到大力發展，一些市（縣）形成了產業化發展格局，有力推動了國家鄉村振興戰略的實施。尤其在湖南通道縣，黑老虎的種植規模迅速擴大，并且獲評國家地理標志農產品[2]。在黑老虎的規模發展過程中，科研人員開展了黑老虎新種質的挖掘和選育研究，并通過嫁接推廣應用。目前已涌現出一批在果形、果色、口感、早實性等方面具特異性的品種（系）。

由于黑老虎的種質特異性，以果實及其經濟性狀為主，加之生長環境導致的營養器官形態變異也較大，在結實前依據形態性狀較難鑒別。由于DNA 標記不受環境和發育時期的影響，構建DNA 指紋圖譜是一種快速且準確的途徑[3]。SSR標記具有多態性高、共顯性遺傳、測試操作簡單、結果重復性好等優點，被國際植物新品種權保護聯盟（International? Union for the Protection of NewVarieties of Plants， UPOV）確定為構建植物品種（系）DNA 指紋數據庫的首選標記[4]，已在寶巾花[5]、梨屬[6]、仁用杏[7]、核桃[8]、薄殼山核桃[9]、苦參[10]以及楊樹[11-12]等觀賞、食用、藥用以及材用植物品種（系）DNA 指紋圖譜上得到廣泛應用。本研究應用SSR 標記技術分析湖南省選育的20個黑老虎品系的遺傳多樣性，探明其親緣關系，構建SSR 指紋圖譜，旨在為黑老虎品種（系）鑒定以及新品種（系）選育與創制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

20個黑老虎品系來自湖南省通道縣獨坡鎮蝦團村、芷江縣大樹坳鄉竹坡村和芷江縣三道坑鎮芷溪村（表1）。其中，通道縣獨坡鎮蝦團村自2004年以來開始發展黑老虎，建立了平寬黑老虎專業合作社，湖南省植物園與當地種植大戶合作收集、保存了大量黑老虎種質資源，部分品系即來自該種質資源圃；其他品系是利用芷江縣大樹坳鄉竹坡村和三道坑鎮芷溪村天然次生林內的黑老虎優株經嫁接而獲得。部分品系特征見圖1。對每個品系采集其嫩葉，用硅膠（質量比為1∶10）干燥帶回實驗室。

1.2 方法

DNA 提取和SSR 分析。采用改良的CTAB法[13]提取DNA，從前期開發的28 對SSR 引種中選擇15 對（表2），應用M13-tailed 引物法進行SSR 分析[1]。采用10 μL 的PCR 擴增反應體系：DNA 模板50 ng，dNTPs 150 μmol/L，MgCl22.0 μmol/L，M13 熒光標記引物0.5 μmol/L，M13熒光標記的正向引物0.5 μmol/L，反向引物0.5 μmol/L，1×PCR 緩沖液以及Taq DNA 聚合酶0.04 U/μL。PCR 緩沖液和Taq DNA 聚合酶由天根生化科技（北京）有限公司生產。在PCR 擴增儀Master cycler Gradient Thermal Cycler （Eppendorf）上進行擴增反應，其程序為：4 min 94 ℃預變性；30 s 94 ℃變性，30 s 60 ℃退火，30 s 72 ℃延伸，循環30 次；10 min 72 ℃延伸。選用GeneScan500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems， USA）為內標，采用3730XL 自動測序儀（Applied Biosystems，USA）檢測PCR 產物的多態性。應用GeneMarker V2.2.0 軟件[14]判讀基因型。

1.3 數據處理

應用Excel 軟件統計每個位點的基因型數量、特異等位基因數（Ap）以及鑒定品系數。應用GenAlEx 6 軟件[15]計算每位點的等位基因數（A）、有效等位基因數（Ae）、Shannon 信息指數（I）、觀測雜合度（Ho）；基于等位基因頻率，采用公式PICi=1-ΣPij2 計算多態信息含量（PIC），PIi=2（ΣPij2）2-ΣPij4 計算基因型相同的概率（PI），其中Pij 為位點i 等位基因j 的頻率[16]；按照各位點及其等位基因的有無構建（ 0， 1 ） 矩陣， 應用NYSYS-pc 2.1 軟件[17]計算品系間的Neis（1972）遺傳距離，基于遺傳距離進行UPGMA（非加權組平均法）聚類分析，繪制親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

15對SSR 引物在20 個黑老虎品系中共檢測到108 個基因型，76 個等位基因，其中18 個為特異等位基因，僅在1 個品系中出現。每個位點的等位基因數（A）為2～15，有效等位基因數（Ae）為1.105～9.412，均以KCZ023 位點最高，15 個位點的A 和Ae 的平均值分別為5.067 和2.866。特異等位基因數（Ap）以KCZ023 和KCZ100 最多，均有4 個。Shannon 信息指數（I）為0.199～2.456，觀測雜合度（Ho）為0.100～0.900，多態信息含量（PIC）為0.095～0.894，亦均以KCZ023位點最高，15 個位點的I、Ho 和PIC 的平均值分別為1.106、0.473 和0.562。基因型相同的概率（PI）為0.020～0.824，以KCZ023 位點為最低（表3）。

2.2 親緣關系分析

20 個黑老虎品系間Neis（1972）遺傳相似系數為0.328～0.891，以TD07 與TD43 間遺傳相似系數最大，TD45 與TD46 間遺傳相似系數最小，其平均值為0.614（表4）。聚類分析發現，以遺傳相似系數0.57 為閾值可將20 個品系分為2 個類群：TD21、TD22、TD42、TD43、TD47、TD50、TD51 和TD54 等8 個品系聚為一類（I）；其他12個品系聚為一類（II）。以遺傳相似系數0.62 為閾值可將第II 類群分為3 個組：TD07、TD41、TD45、TD46、TD52、ZJ34、ZJ40 等7 個品系為一組；TD08 和TD19 為一組；TD23、TD40、TD44 為一組（圖2）。

2.3 DNA 指紋圖譜構建

由表5 可知，15 個SSR 位點均不能單獨將20 個黑老虎品系完全區分開。其中，KCZ023 位點的區分能力最強，能單獨鑒別15 個品系，占75%；其次為KCZ035 位點，能單獨區分7 個品系，占35%；再次為KCZ100 和KCZ113，均能單獨鑒定出5 個品系，占25%；KCZ029、KCZ058和KCZ061 位點均不能單獨區分任何品系。

從表5 可以看出，位點兩兩組合中，KCZ023與KCZ059、KCZ023 與KCZ135 以及KCZ023 與KCZ147 等3 個組合中的任意一個均能將20 個品系完全區分，其他組合均不能將20 個品系完全區分。3 位點組合中，共有28 個組合能將20 個黑老虎品系完全區分，包括：（1）KCZ023 與KCZ035或KCZ023 與KCZ100，加上KCZ036、KCZ057、KCZ061、KCZ103 和KCZ113 的任意一個位點，計10 個組合；（2）KCZ035 與KCZ057，或KCZ035與KCZ059，或KCZ035 與KCZ100，加上KCZ103或KCZ135，計6 個組合；（3）KCZ035 與KCZ113加上KCZ059 或KCZ100 ， 以及KCZ035 與KCZ147 加上KCZ057 或KCZ059，計4 個組合；（ 4 ） KCZ035 與KCZ103 加上KCZ113 或KCZ135，以及KCZ035 與KCZ113 加上KCZ135或KCZ147，計4 個組合；（5）KCZ035、KCZ036和KCZ059，KCZ035、KCZ135 和KCZ147，KCZ057、KCZ100 和KCZ113 以及KCZ100、KCZ113 和KCZ135 等4 個組合。

3討論

本研究應用15對SSR 引物研究了20 個黑老虎品系的遺傳多樣性，檢測到76 個等位基因、18個特異等位基因和108個基因型，尤其是KCZ023位點具有15 個等位基因，高于該位點在城步、桂東和會同3 個天然群體所檢測到的等位基因數（13）[1]，而且該位點對于黑老虎品系的區分能力最強，可單獨區分15 個品系，可作為黑老虎品系鑒定的核心位點。20 個品系的多態信息含量（PIC）為0.095～0.894，絕大多數高于城步、桂東和會同3 個天然群體[1]，說明20 個黑老虎品系具有較高的遺傳多樣性。其原因可能是：盡管20個品系絕大部分來自湖南通道縣獨坡鎮蝦團村，由于通道縣位于湖南、貴州和廣西三省（區）交界處，亦是人工種植黑老虎最早的地區之一[2]，當地種植大戶從各地廣泛收集黑老虎種質資源進行種植，湖南省植物園在當地種植大戶的基礎上也開展了黑老虎種質資源的收集、保存和新品種（系）選育研究，使選育的品種（系）多樣性較為豐富。

20個黑老虎品系間的遺傳相似系數為0.328～0.891，依據遺傳相似系數進行UPGMA聚類分析，可將20 個黑老虎品系劃分為2 個類群，其親緣關系與各品系的果色、果形、風味等性狀并無明顯的相關性。如，TD45 和TD46 兩個品系的親緣關系最近，而果實顏色迥異，分別為紫黑色和粉色；同為早熟的TD44 和TD47 兩個品系的親緣關系較遠，分別屬于不同的類群；親緣關系最遠的2個品系TD07 和TD43 在果色和口感上也差異明顯，前者為虎綠、口感一般，而后者通常為紫紅色，果肉多且甜。這與本研究使用的SSR 標記有關，因為這些SSR 標記是通過簡化基因組測序開發而獲得的[1]，多為中性標記。

目前黑老虎種質主要通過嫁接方式無性系化進行推廣應用。本研究構建了20 個黑老虎品系的SSR 指紋圖譜，從3 個2 位點組合和28 個3 位點組合中選擇任意組合均能將20個品系完全區分。15 個位點中，滿足PIC＞0.5 和PI＜0.2 的位點為KCZ023、KCZ035、KCZ059、KCZ100、KCZ113和KCZ135，說明這些位點均具有足夠的區分能力[16]，其組合可優先應用于黑老虎品系的鑒定。盡管嚴格意義上而言，對于有限數量的品系，DNA 指紋圖譜可用于區分品系，但未能應用于直接鑒定[18]。然而這20 個品系涵蓋了目前生產上應用的種質，應用這些SSR 指紋圖譜，可以區分在形態上相似的品系，如，果色同為虎綠的TD07和TD52，同為長形果的TD42 和TD50；亦可以為黑老虎品系嫁接苗的管理提供參考[19]。

綜上所述，本研究揭示了20個黑老虎品系的遺傳多樣性和親緣關系，構建了SSR 指紋圖譜，能夠準確區分這些品系，不僅利于黑老虎品種（系）鑒定，也可應用于黑老虎的雜交親本選配。黑老虎具有保健食用、藥用以及觀賞價值，隨著新種質的不斷挖掘，新品種（系）將不斷涌現，SSR指紋圖譜也需要不斷更新；另一方面，針對其表型性狀的獨特性開發轉錄組SSR 標記，并應用于SSR 指紋圖譜構建，從而使指紋圖譜更好地應用于生產實踐。