CO2加富條件下胡蘿卜光合通路及差異基因表達分析

宋甜月，劉 偉，宋紅霞

（山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

胡蘿卜（Daucus carotaL.）又稱“長壽菜”“土人參”“金筍”，原產于中亞細亞一帶，元末時傳入我國，在全國各地廣泛栽培[1]。胡蘿卜具有很高的營養價值，富含維生素C、類胡蘿卜素和人體必需的酶等，胡蘿卜素能夠在體內轉化為維生素A，不僅能保護視力，還能保證人體生長發育需要，增強免疫力[2-3]。近年來，設施農業發展迅速，但是溫室、大棚低溫季節為保溫其內部相對封閉，導致CO2虧缺，影響作物的光合效率[4]。

CO2是植物光合作用的原料[5]，是光合作用能夠進行的物質基礎之一，其濃度變化直接影響光合能力的大小。CO2加富能提高植物光捕獲系統活性，促進光合電子傳遞，提高植物光合速率，增加干物質積累，促進植物的生長發育，提高作物品質，因此，設施內增施CO2是促進植物生長發育和光合作用的重要途徑之一[6-7]。光合作用是生物界極其重要的反應，可分為3部分：光能吸收傳遞與轉換、電子傳遞和光合磷酸化、碳同化。光系統Ⅱ（Photosystem Ⅱ，PSⅡ）復合體、光系統Ⅰ（Photosystem Ⅰ，PSⅠ）復合體、細胞色素b6f（Cytb6f復合體）和ATP合酶復合體是主要的光合作用進行的膜蛋白復合體[8-10]，Cytf是細胞色素b6f復合體的組分之一，參與真核生物光合電子傳遞過程，連接PSⅡ和PSⅠ的電子流，在光合作用中起重要作用[11]。研究表明，CO2濃度的高低調控參與光反應的基因表達，進而影響植物的生長發育[12]，增施CO2能顯著促進作物幼苗的生長，提高壯苗指數，對作物的株高、葉片數、根冠比、干質量、鮮質量都有增加的效果[13]。任宏芳等[14]研究發現，CO2濃度升高顯著增加谷子的株高、穗長、葉質量、莖質量、穗質量和地上部生物量，且使谷子產量增加28.7%。

目前，關于CO2加富對植物的影響主要集中在生理特性方面的研究[15-16]，在光合通路及差異基因分析上的相關研究較少。本試驗以橙色胡蘿卜為材料，通過轉錄組測序技術，研究CO2加富對胡蘿卜光合通路及相關基因的影響，旨在為合理增施CO2促進胡蘿卜生長發育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試橙色胡蘿卜為山西農業大學選育的甜紅1號的母本。其肉質根為圓錐形，肉質根內芯柱比較細嫩，表皮光亮，生育期為110～120 d，適應性強。

1.2 試驗方法

試驗于2019年9—12月在山西農業大學園藝站的日光溫室中進行。9月29日進行小高壟播種，壟寬40 cm，壟間距50 cm，小區面積為5 m2。

1.2.1 試驗設計 在日光溫室中分別設置富碳區（FC，CO2濃度為（800±50）μmol/mol）和對照 區（CK，自然環境），其中，富碳區使用CO2自動釋放系統的裝置，以CO2鋼瓶為氣源。10月31日開始晴天9：00—11：00釋放，雪天和雨天不釋放，其余均為常規操作。

1.2.2 產量指標測定 收獲期分別統計富碳區和對照區的總生物學產量、地上部鮮質量和地下部鮮質量，并計算小區產量，折合公頃產量。

1.2.3 取樣及轉錄組測序 富碳處理61 d（12月28日）后，于晴天10：00取樣，分別從自然環境和富碳環境選取3株長勢相同、生長健壯的植株，選取第4片功能葉混合取樣，每個樣品約0.1 g，3次生物學重復。取樣后用液氮冷凍保存，用于RNA的提取及表達譜的測序。總RNA的提取和測序工作由北京百邁克公司完成。測序步驟、表達量分析、功能注釋、代謝途徑的分析方法同文獻[17]。

1.2.4 KEGG代謝途徑分析 首先，通過測序獲得原始測序數據，然后進行數據的質量評估，包括GC content和99.9%堿基識別精度等，然后對富碳處理后的差異基因進行KEGG注釋，再進行KEGG代謝途徑分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用基因特異性引物進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。使用Primer 3.0軟件設計引物序列（表1），對gene33346、gene33340和gene33386等3個光合相關基因進行實時熒光定量PCR驗證，反應體系為（25 μL）：12.5 μL SYBR、2 μL引 物、2 μL cDNA和8.5 μL ddH2O；反應程序為：95 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，循環40次。

表1 光合相關基因qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR of photosynthesis-related genes

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 20.0進行整理和分析。

2 結果與分析

2.1 CO2加富環境對胡蘿卜產量的影響

從表2可以看出，CO2加富后，其總生物學產量、地上部質量、地下部質量均顯著高于對照區（P<0.05），分別較對照增加了39.02%、80.25%、26.68%。富碳處理和對照處理的胡蘿卜地下部鮮質量均大于地上部鮮質量；富碳區的單根質量達到了170 g以上，增幅明顯，增施CO2后小區凈產量有所增加，增產效果明顯，折合公頃產量高達42688.76 kg，較對照區增產36.56%。

表2 CO2加富對胡蘿卜產量的影響Tab.2 The effect of CO2 enrichment on the yield of carrot

2.2 測序結果質量評估

對6個樣品CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3進行轉錄組分析，共獲得41.21 Gb高質量測序數據。將原始數據進行統計分析，結果如表3所示，CK-1、CK-2、CK-3、FC-1、FC-2、FC-3這6個基因文庫分別獲得Clean reads數分別為26650192、26920393、25945139、22204974、24809680、21642183條；Clean bases總堿基分別為7957707794、8037639700、7737059862、6624198608、7401073402、6455939670個；GC Content分別占總堿基數的45.27%、45.39%、45.31%、45.26%、45.05%、45.42%，說明測序中G和C、A和T含量相當，堿基類型沒有分離現象，測序過程較穩定。對照處理的各樣品Q30堿基百分比分別為95.57%、95.70%、95.57%，CO2加富處理的各樣品Q30堿基百分比分別為95.81%、95.24%、95.74%，均大于95.24%，說明測序結果較為準確，可以用于后續轉錄組測序分析。

表3 樣品測序數據評估統計Tab.3 Evaluation statistics of sample sequencing data

2.3 KEGG顯著性分析

如表4所示，以P-value≤1.5為標準篩選差異基因KEGG的代謝通路，篩選到6條差異基因顯著富集的代謝通路，分別為光合通路（ko00195）、植物激素信號轉導通路（ko04075）、α-亞麻酸新陳代謝（ko00592）、類胡蘿卜素生物合成（ko00906）、亞油酸代謝（ko00591）、氧化磷酸化（ko00190）。其中，光合通路（Photosynthesis）為第1顯著富集通路，其次是植物激素信號轉導通路（Plant hormone signal transduction）和α-亞麻酸新陳代謝通路（alpha-Linolenic acid metabolism），KEGG通路分析結果說明，CO2加富首先對光合、激素、α-亞麻酸和類胡蘿卜素生物合成產生了顯著影響。

表4 差異表達基因KEGG富集結果Tab.4 KEGG enrichment results of differentially expressed genes

光合作用是將光能轉化為化學能的過程，分為光能吸收傳遞與轉換、電子傳遞和光合磷酸化、碳同化。光合膜上的色素蛋白復合物按照功能通常分為：光系統Ⅱ（PSⅡ）、光系統Ⅰ（PSⅠ）、Cytb6f復合物及ATP合成酶復合物，在這4個蛋白復合體共同參與下，光合作用中的光反應完成了電子從H2O到NADP+的傳遞過程，并產生ATP和釋放出O2。以PC值≥2為基因顯著表達，圖1（響應CO2加富的植物光合通路（KO00195））中標紅基因表示表達量上調，富碳條件促進了光合電子傳遞和光合磷酸化過程以及相關酶和蛋白的合成，從而使得光系統Ⅰ相關基因（psaA和psaB與色素結合）、光系統Ⅱ相關基因（psbD、psbC、psbB、psbH、psbZ控制PSⅡ有關蛋白合成）、Cytb6f蛋白復合體（是連接2個光系統的電子傳遞體）相關基因（petB、petA）、ATP合成酶相關基因（gene33327）表達量上調。

圖1 植物光合通路Fig.1 Plant photosynthetic pathway

2.4 光合相關差異表達基因分析

對比富碳區和對照區下的胡蘿卜葉片轉錄組數據，發現富碳區下與光合相關的差異表達的基因有11個，參與反應的酶涉及10種。如表5所示，通過與擬南芥同源基因對比分析，其中gene33346和gene33347的編碼基因分別為psaB和psaA，psaB和psaA是PSⅠ光反應中心的基本多肽結構，psaA控制合成的亞基PsaA功能是捕光，psaB控制的亞基PsaB功能是電荷分離、光保護、電荷穩定，葉綠素和β-胡蘿卜素都與它們結合；gene33382、gene33314、gene33340、gene33339、gene33385和gene23768均為PSⅡ核心復合體的組成蛋白，參與放氧過程，其編碼基因分別為psbB、psbA、psbC、psbD、psbH、psbB，PSⅡ結合許多色素分子，包含葉綠素、β-胡蘿卜素和葉黃素。psbB、psbC是核心天線，psbA、psbD是反應中心蛋白。psbH是細胞色素b559的亞基，其功能未知。gene33366和gene33386均為細胞色素b6f（Cytb6f復合體），其編碼基因分別為petA、petB。gene33327為ATP合酶跨膜的CF0單位的亞基，負責組織和穩定CF0的結構。這11個基因在CO2加富條件下均上調表達，說明CO2加富可能均促進了胡蘿卜的光合作用。

表5 CO2加富條件下胡蘿卜光合相關基因分析Tab.5 Analysis of carrot photosynthesis-related genes under CO2 enrichment

gene33346、gene33340和gene33386這3個基因分別代表光系統Ⅰ、光系統Ⅱ和細胞色素b6的相關基因，具有一定的代表性。所以，選取這3個光合相關基因進行RT-qPCR差異表達性分析，同時與轉錄組數據中的FPKM值進行對比，試驗結果表明（圖2），富碳處理的gene33346、gene33340和gene33386這3個基因的相對表達水平均極顯著高于對照處理（P<0.01），且其相對表達量與相應的FPKM值趨勢一致，說明轉錄組測序結果是準確的，CO2富集影響基因表達，從而推測這些基因可能參與光合作用。

圖2 RT-qPCR驗證Fig.2 RT-qPCR validation

3 結論與討論

近年來，大氣CO2濃度逐漸升高，將會對植物生長發育及生態環境產生影響；而光合作用是植物利用光，以CO2和水為原料，合成碳水化合物的過程[18]。合理增高CO2濃度，可以為光合過程提供充足的原料，增強光合過程中對CO2的固定能力，提高光合色素和葉綠素含量，提高植物的光能利用率，促進光合電子傳遞，從而提高光合作用，最終達到增產的目的。本研究結果表明，增施CO2后胡蘿卜的總生物學產量、地上部質量、地下部質量以及折合公頃產量均高于未施CO2的對照處理，且較對照處理增產36.56%，這與LI等[19]在板藍根的研究（增產36.8%）和劉月炎等[20]在虎耳草的研究（增產23.45%）結果相似。而關于該過程的分子響應機制如何，ZHANG等[21]揭示了當CO2濃度升高后，在沙棘中GO功能主要富集在光合系統Ⅰ、光合作用和葉綠體類囊體膜中；趙靜[22]通過分析比較自然和富碳條件下草莓葉片的轉錄組數據，推測與光合有關的差異表達基因共有15個，其中上調表達基因有10個。本試驗中，富碳條件下，光合通路為第1顯著富集的通路，光合相關基因表達上調，這可能是由于富碳條件促進了光合電子的傳遞及相關酶的合成。

研究表明，銀杏葉光合作用基因ESTs為97條，與光反應相關的基因主要有PSⅡ捕光葉綠素a/b結合蛋白、PSⅠ捕光葉綠素a/b結合蛋白、PSⅠ反應中心亞單位、鐵硫蛋白、鐵氧蛋白還原酶、ATP合成酶等[23]。psaA或psaB基因的失活都會導致PSⅠ復合物在類囊體中缺失，表明psaA或psaB不能單獨形成二聚體，而psaA-psaB異二聚體的存在是整個PSⅠ復合物組裝所必需的[24]。本試驗中，通過與擬南芥同源基因對比分析，發現gene33346和gene33347的編碼基因分別為psaB和psaA，其在CO2加富條件下均上調表達，表明富碳條件下促進了PSⅠ復合物的合成。核心天線CP47和CP43分別是由葉綠體psbB和psbC基因編碼的47 ku和43 ku蛋白結合葉綠素a所構成的蛋白復合物[25]。gene33314的編碼基因為psbA，psbA基因編碼光系統Ⅱ的D1蛋白，在光化學反應中心負責電荷分離和電子轉移[26]，而這在其中發揮著重要作用。gene33366和gene33386均為細胞色素b6f（Cytb6f復合體），是光合電子傳遞鏈中3個重要的膜蛋白復合體之一，位于光系統Ⅱ和系統Ⅰ之間，介導2個光系統之間的電子傳遞，同時作為質子泵跨膜轉運質子，為ATP合成提供能量[27]。本試驗中，CO2處理的gene33386的表達量顯著高于對照，這可能是因為gene33386促進了2個光系統之間的電子傳遞。以上結果表明，CO2加富處理可積極調控這些基因的表達，促進胡蘿卜光合作用。

綜上所述，本研究共獲得41.21 Gb Clean data，各樣品Q30堿基百分比均不小于95.24%。KEGG分析表明，差異表達基因顯著富集的第1條通路為光合通路，通過與擬南芥同源基因對比分析，發現富碳條件下11個光合相關基因表達上調，這些基因涉及色素合成、電子傳遞、ATP合成、有關酶的合成等，其中gene33346、gene33340和gene33386這3個光合相關基因的相對表達量與其FPKM值趨勢一致，對進一步研究CO2施肥對胡蘿卜光合作用的分子機制研究具有重要意義。