菌/酶添加對甜高粱渣青貯預處理作用的強化效果

任海偉，石瑞鋒，魏慧元，王 莉，郭曉鵬，陸 棟，劉瑞媛，李金平

·農產品加工工程·

菌/酶添加對甜高粱渣青貯預處理作用的強化效果

任海偉1,2,3，石瑞鋒1，魏慧元1，王 莉1，郭曉鵬1，陸 棟4，劉瑞媛4，李金平2,3※

（1. 蘭州理工大學生命科學與工程學院/西部能源與環境研究中心，蘭州 730050；2. 甘肅省生物質能與太陽能互補供能系統重點實驗室，蘭州 730050；3. 西北低碳城鎮支撐技術協同創新中心，蘭州 730050；4. 中科院近代物理研究所，蘭州 730050）

為實現生物質甜高粱渣的青貯強化預處理和能源化利用，該研究探究了不同添加劑對其青貯質量和酶解糖化效果的影響。試驗設置對照組（CK組）、植物乳桿菌組（L組）、纖維復合酶組（E組）和復合添加劑組（LE組），系統考察甜高粱渣在21 d青貯預處理期間的營養成分、木質纖維組分和發酵品質的動態變化，采用隸屬函數法評價青貯質量，利用高通量測序技術分析青貯預處理過程的微生物菌群動態演繹。結合酶解糖化性能評價青貯預處理作用的強化效果，從而篩選適宜的添加劑。結果表明：青貯預處理后甜高粱渣的粗蛋白、淀粉、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、半纖維素和纖維素等能量組分含量顯著高于原料（<0.05）。青貯21 d時，3個添加劑組的干物質、可溶性碳水化合物和粗蛋白含量顯著高于CK組（<0.05），綜纖維素含量顯著低于CK組（<0.05），且E組的干物質含量最高，L組的粗蛋白含量最高，E組和LE組的可溶性碳水化合物含量最高。青貯預處理期間，3 個添加劑組的pH值均低于4.2，L組的乳酸和乙酸含量明顯高于CK組（<0.05），E組的乳酸/乙酸和乳酸/總有機酸比值顯著高于CK組（<0.05）。隸屬函數法綜合評價E組的青貯發酵質量最高。微生物菌群結果顯示，甜高粱渣經青貯預處理后，3個添加劑組的細菌菌群豐富度和多樣性都明顯下降，門水平細菌主要以變形菌為主，屬水平細菌主要包含腸桿菌、泛菌、明串珠菌、魏斯氏菌、拉恩氏菌和葡糖桿菌等，這些微生物與青貯質量密切相關。甜高粱渣經青貯預處理后的還原糖得率顯著提升，尤其E組得率比原料提高了117%。結合成本效益法分析，利用纖維復合酶對甜高粱渣進行青貯強化處理的E組純收益最高，較甜高粱渣原料提高了近3倍。總之，單獨添加纖維復合酶不僅能明顯改善甜高粱渣的青貯發酵質量，實現穩定保存，還能使其青貯預處理作用得到強化，進而提高甜高粱渣的生物降解性能，是一種經濟合理、技術可行的青貯預處理強化方法。

青貯；發酵；植物乳桿菌；纖維復合酶；甜高粱渣；微生物菌群；酶解糖化

0 引 言

中國生物質資源量豐富，年均產生量約34.94億t（折合4.6億t標煤），目前已實現能源化利用的資源量約4.61億t，碳排量減少約2.18億t。預計2030年各類生物質能的利用將會為全社會減少碳排放約9億t，到2060年將實現碳減排約20億t。因此，大力發展生物質能等清潔能源不僅是“十四五”期間生物經濟和可再生能源發展的重點方向，也是中國順利實現“雙碳”目標的重要途徑。甜高粱是一種C4能源植物，具有耐旱、耐鹽堿、生物產量高等特點。甜高粱莖汁含有豐富的葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性碳水化合物，能發酵制取氫氣、丁酸等產品[1-2]。榨汁后的甜高粱渣富含纖維素、半纖維素等結構性碳水化合物，被廣泛用于生物乙醇、生物甲烷、復合材料、動物飼料等領域[3-4]。據不完全統計，2022年中國甜高粱種植面積約4.88萬hm2，產量約475萬t，其榨汁后可產生甜高粱渣136.4萬t，資源量巨大[3]。由于甜高粱渣的水分、糖分等營養物質含量還相對較高，若不能及時保質貯存和高效利用，不僅容易造成腐敗變質和資源浪費，還會帶來環境污染等問題。

青貯作為一種典型的濕法貯存技術，不僅能延長生物質原料貯存時間，有效保存其營養物質和能量組分，還能起到一定的生化預處理作用[5-6]。同時，添加乳酸菌、酵母菌、木質纖維分解菌等微生物菌劑以及酶制劑和有機酸等添加劑能在一定程度上強化青貯預處理作用，進而提高其生物降解性能和乙醇、甲烷等能源產出[7-8]。XING等[7]發現高粱秸稈青貯過程中加入復合酶（纖維素酶和半纖維素酶）能顯著降低中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量，提高青貯質量。USMAN等[9]發現添加產阿魏酸酯酶的植物乳桿菌能促進高粱秸稈的青貯發酵，降低pH值并抑制不良微生物生長，提高還原糖和乙醇發酵得率。WRIGHT等[10]發現通過青貯甜高粱渣可有效抑制不良微生物，獲得穩定保存并用于能源生產。WILK等[11]發現添加布氏乳桿菌能促進青貯甜高粱渣的異型乳酸發酵，提高乙酸含量，改善有氧穩定性，強化青貯效果。DONG等[12]認為甜高粱渣青貯中添加植物乳桿菌、布氏乳桿菌和纖維素酶進行聯合強化作用后，可獲得低pH值、高含量乳酸和可溶性碳水化合物。ZEGADA-LIZARAZU等[13]認為聯合添加布氏乳桿菌和干酪乳桿菌能顯著降低青貯甜高粱渣的干物質損失，提高乳酸、乙酸和丙酸含量及產甲烷潛力。但有關纖維復合酶、植乳乳桿菌對甜高粱渣青貯預處理效果評價的研究還鮮有報道。

本文以甜高粱渣的保質貯存和強化生物降解為目標，探討了甜高粱渣青貯預處理過程中添加植物乳桿菌、纖維復合酶（纖維素酶和木聚糖酶）對木質纖維等有機組分、青貯發酵品質的動態影響并通過HiSeq2500高通量測序平臺分析青貯過程中的細菌群落動態演繹進程，通過酶解糖化試驗比較不同添加劑對青貯預處理作用的強化效果，同時結合成本效益法綜合評價不同添加劑的經濟合理性，進而篩選適宜的添加劑，以期為甜高粱渣木質纖維組分高效轉化和能源化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

甜高粱（KFJT-3品系）原料來自中科院近代物理研究所白銀種植基地，榨汁后切短至1～2 cm備用。植物乳桿菌（ACCC11016）購自中國農業微生物菌種保藏管理中心。

青貯預處理所用纖維復合酶（含纖維素酶和木聚糖酶，復合比4∶1）購于寧夏和氏璧生物技術有限公司。依《飼用纖維素酶活性的測定：GB/T 23881-2009》和《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定：GB/T 23874-2009》測得該復合酶的纖維素酶活力為60 000 U/g，木聚糖酶活力為20 000 U/g，綜合酶活力為52 000 U/g。酶活力定義：1 g酶粉于50 ℃、pH 值5.0條件下，1 min水解羧甲基纖維素或木聚糖產生1 μg葡萄糖或木糖的酶量為1個酶活力單位。

1.1.2 試驗儀器與設備

F800纖維分析儀和K9840 半自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技公司；SpectraMax M5酶標儀，Molecular Devices公司。

1.2 青貯發酵試驗設計

準確稱取一定量甜高粱渣原料（sweet sorghum bagasse，SSB），與不同添加劑充分混勻后立即裝入聚乙烯包裝袋，抽真空后迅速密封，常溫（20±2） ℃下避光青貯21 d。每隔7 d定期取樣分析有機組分、發酵品質和微生物菌群多樣性。添加劑加入量均以原料鮮重（fresh weight，FW）為基礎，設置植物乳桿菌組（L組，添加量1×108CFU/g 以FW計，下同）、纖維復合酶組（E組，添加量3 g/kg）和菌酶聯合處理組（LE組，植物乳桿菌添加量1×108CFU/g，纖維復合酶添加量3 g/kg）3個添加劑處理組和1個空白對照組（CK組，青貯時添加等量蒸餾水），每個試驗組3個平行[14]。

1.3 青貯質量評價

1.3.1 有機組分含量分析

干物質（dry matter，DM）、水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、粗蛋白（crude protein，CP）、淀粉（starch，ST）、中性洗滌纖維NDF（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維ADF（acid detergent fiber，ADF）和酸性洗滌木質素ADL（acid detergent lignin，ADL）等組分測定參考文獻[15]進行。纖維素CL（cellulose，CL）、半纖維素HC（hemicellulose，HC）和綜纖維素HoC（holocellulose，HoC）含量依式（1）～（3）計算[16]。

CL=ADF-ADL（1）

HC=NDF-ADF（2）

HoC=CL+HC（3）

1.3.2 青貯發酵品質分析

pH值測定采用UB-7酸度計，氨態氮（ammonia nitrogen，AN）分析采用苯酚-次氯酸鈉比色法，乳酸、乙酸、丙酸等有機酸產物分析采用安捷倫1 200高效液相色譜儀檢測，配置 KC-811 離子柱和 DAD 檢測器，柱溫50 ℃，流動相3 mmol/L HClO4溶液，進樣量 5 μL[6]。

1.3.3 青貯質量綜合評價

采用模糊數學隸屬函數法對有機組分和發酵特性等9個指標進行綜合評價[17]，計算參考式（4）～（5）。以全部指標隸屬函數值平均值大小進行排序。

U（+）=（X-min）/（max-min）（4）

U（-）=1-（X-min）/（max-min）（5）

式中U（+）為各指標正相關隸屬函數值；U（-）為各指標負相關隸屬函數值；X為某指標測定值；min和max分別為某指標所有測定值的最小值和最大值。

1.3.4 青貯預處理前后的甜高粱渣生物降解性能評價

采用酶解糖化方法評價其生物降解性能。準確稱取0.5 g甜高粱渣原料或青貯21 d樣品，按照1∶20（g/mL）料液比加入檸檬酸緩沖液（pH 值為4.8，0.05 mol/L），然后依次添加購自北京索萊寶科技有限公司的纖維素酶（標注酶活力3 000 U/g，加酶量1 000 U/g）、半纖維素酶（標注酶活力1 500 U/g，加酶量500 U/g）和-葡聚糖苷酶（標注酶活力3 300 U/mg加酶量1 U/g）進行酶解反應，對照組加入等量蒸餾水，恒溫振蕩酶解72 h，間隔12 h測定酶解液中的單糖組分。葡萄糖與木糖得率按式（6）～（7）計算，還原糖得率由各單糖得率相加[18]。

式中Y為葡萄糖得率，mg/g；Y為木糖得率，mg/g；為單糖濃度，g/mL；為上清液體積，mL；為稀釋倍數；為樣品質量，g；0.9為葡萄糖與葡聚糖轉化系數；0.88為木糖與木聚糖轉化系數。

1.4 青貯發酵過程的微生物菌群分析

依Water DNA試劑盒步驟提取微生物總DNA。PCR 擴增區域16SrDNA V3-V4 區，選擇引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3'）。采用 PCR儀對細菌16SrDNA基因進行 PCR 擴增。每個樣本3個重復，將同一樣本的 PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl 洗脫；最后采用NaOH對PCR產物變性，產生單鏈DNA片段，用HiSeq2500平臺進行測序。測序結果與NCBI基因庫進行比對，按照97%相似性水平劃分操作分類單元（OTU）。采用QIIME軟件計算Shannon和Chao1等Alpha多樣性指數，選取相對豐度高于0.1%的細菌類群進行門、屬水平分析，并基于屬水平相對豐度構建主坐標分析（PCA）[19]。

1.5 經濟效益指標分析

運用成本收益法對甜高粱渣青貯預處理過程涉及的成本投入和綜合收益進行計算。根據成本收益理論構建適宜的青貯預處理成本收益模型，計算式為

I=M·-W·-(E+1)（8）

M=W·R（9）

式中表示甜高粱渣（原料或青貯預處理）的純收益，元；表示每噸甜高粱渣（原料或青貯預處理）酶解糖化后的還原糖質量，t；表示每噸甜高粱渣（原料或青貯預處理）的干基質量，t；表示酶解糖化后的還原糖得率，mg/g；表示還原糖的市場收購價格，4 520元/t，（參考99%葡萄糖售價）；表示纖維素酶解成本，1 300 元/t 以計[20]；表示每噸甜高粱渣的青貯成本，元/t（含添加劑成本）；1表示每噸甜高粱渣的收購成本，元；表示原料或不同預處理方法。

1.6 數據分析

經Excel 2019軟件整理原始數據，采用平均值±標準差表示。使用SPSS 26.0軟件進行雙因素方差分析，單因子 ANOVO模型處理及Duncan方法對數據進行多重比較分析，數據用平均值±標準差表示，使用Origin 9.0軟件繪制圖表。<0.05 代表數據差異顯著，>0.05代表數據差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯預處理過程中營養成分的變化

2.1.1 干物質與干物質損失率

甜高粱渣中的干物質主要包括粗蛋白、淀粉和可溶性碳水化合物等，其含量高低能綜合反映青貯質量優劣，這些組分的含量越高，說明營養物質損失越少，青貯品質越好[21]。由圖1a可知，與原料相比，4個試驗組在青貯7d時的干物質含量顯著下降（<0.05），這是因為青貯初期原料附著的乳酸菌等微生物菌群利用WSC和淀粉等易降解組分發酵產生有機酸、CO2和H2O所致[22]。青貯14和21 d時，4個試驗組的DM含量總體保持穩定，其中E組在14和21 d呈現升高趨勢，說明添加纖維復合酶有助于減緩干物質損失。寇江濤等[23]也認為纖維素酶和木聚糖酶能減少青貯過程中營養物質的損耗，提高青貯DM含量。原因在于纖維復合酶的添加有效分解了植物細胞壁中的纖維素和半纖維素等結構性碳水化合物，為有益乳酸菌等微生物活動提供了充足的發酵底物，促進了發酵進程。同時，隨著乳酸等有機酸積累和pH值降低，也抑制了其他不良微生物活性，進而減少干物質損耗。這與E組在21 d青貯期間的干物質含量顯著高于CK組（<0.05），干物質損失率顯著低于CK組（<0.05）結果相吻合。

注：CK，對照組；L，植物乳桿菌處理組；E，纖維復合酶處理組；LE，菌酶聯合處理組。不同大寫字母表示相同處理組不同時間差異顯著（P<0.05）；不同小寫字母表示相同時間不同處理組差異顯著（P<0.05）。下同。

2.1.2 粗蛋白

粗蛋白含量是反應青貯質量優劣的重要指標。由圖 2a可知，青貯甜高粱渣的CP含量均顯著高于原料（<0.05），且青貯21 d時，3個添加劑組均顯著高于CK組（<0.05），說明青貯發酵有利于減少CP損失，尤其加入植物乳桿菌和纖維復合酶等添加劑對保存CP均能起到積極作用。L組的CP含量在21 d青貯期間始終處于最高值，顯著高于其他試驗組（<0.05）。這是因為植物乳桿菌的加入能使青貯發酵過程中的乳酸菌等有益微生物迅速繁殖，代謝產生大量乳酸并使pH值下降，從而抑制有害微生物對蛋白質和氨基酸的分解[24]。另一方面，植物蛋白水解酶的最適pH值為5.5，低pH的酸性青貯環境也會抑制植物蛋白水解酶活性，從而減少CP分解[25]。XING等[7]也認為添加植物乳桿菌有利于保存青貯甜高粱的蛋白組分。

2.1.3 淀粉

淀粉是甜高粱渣中重要的非結構性碳水化合物。從圖2b可以看出，青貯7 d時甜高粱渣的淀粉含量均顯著高于原料（<0.05），其中CK組的淀粉含量隨青貯時間延長總體呈現升高趨勢，而其余3個添加劑組則呈現先升高后下降趨勢，使得L組、E組和LE組的淀粉含量在7 d時均顯著高于CK組（<0.05），在14和21 d時顯著低于CK組（<0.05）。原因可能是因為青貯前期植物乳桿菌和纖維復合酶添加劑能強化青貯發酵進程，加快體系中的乳酸和乙酸等有機酸積累，進一步使pH值快速下降，并有效抑制芽孢桿菌等可降解淀粉微生物的活性，減少了青貯初期的淀粉消耗[26]。但隨著青貯過程的繼續，青貯微生物菌群不斷發生變化，可能會形成具有能分泌淀粉酶的微生物菌群，并使之發生降解，導致3個添加劑組在14和21 d時的淀粉含量明顯低于CK組。申瑞瑞等[24]報道的研究結果也證實了這一點。

圖2 青貯預處理過程中粗蛋白、淀粉和可溶性碳水化合物含量的動態變化

2.1.4 可溶性碳水化合物

WSC是青貯發酵微生物菌群繁殖代謝的重要底物，WSC≥7%（DM）是青貯pH值能否快速下降的關鍵[27]。試驗中，甜高粱渣原料的WSC含量能完全滿足青貯啟動之必要條件。青貯7 d時，4個試驗組的WSC含量均明顯下降（<0.05），原因在于青貯發酵初期體系中的微生物菌群活動頻繁，WSC作為代謝底物被優先消耗[28]。青貯21 d時，3個添加劑組的WSC含量顯著高于CK組（<0.05）。這是因為低pH值的青貯環境抑制了體系內不良微生物菌群的代謝活性，使3個添加劑組中WSC的消耗量低于CK組；同時青貯體系中加入的植物乳桿菌和纖維復合酶等添加劑在一定程度上也促進了纖維素、半纖維素、淀粉等碳水化合物的分解，使之相較于CK組而言形成了更多的WSC[9,23]。DONG等[12]認為添加商業乳酸菌和菌酶制劑（植物乳桿菌、布氏乳桿菌和纖維素酶）有利于保存青貯甜高粱渣中的WSC組分。FOSTER等[29]也認為在甜高粱青貯中添加纖維素酶和木聚糖酶能提高WSC含量。總之，甜高粱渣青貯預處理過程中加入添加劑有利于甜高粱渣WSC含量保存。

2.2 青貯預處理過程中木質纖維組分變化

木質纖維組分主要包括NDF、ADF、ADL、CL和HC等，這些組分既是甜高粱渣的重要能量組分，也對其降解性能有很大影響。由表1可知，發酵時間、添加劑和其交互作用對青貯甜高粱渣的木質纖維組分含量均有極顯著影響（<0.001）。具體地，青貯7 d時，4個試驗組的ADF和NDF含量均顯著高于原料（<0.05），且NDF含量隨時間延長總體呈現顯著增加趨勢，3個添加劑組的ADF含量則呈現先升高后下降趨勢，分別在7 d和14 d時達到最高值。這是因為木質纖維組分因其致密的抗降解屏障網絡空間結構，較難被青貯微生物菌群利用，這與ZHANG等[5]研究結果一致。然而，DONG等[12]發現甜高粱渣在青貯60 d時的NDF和ADF含量均呈下降趨勢，說明較長時間的青貯預處理能顯著降低NDF和ADF含量。本試驗的青貯周期相對較短（21 d），使得青貯發酵過程中蘊藏的生物預處理作用尚未能充分發揮效果。

ADF是生物質經過酸性處理后，不溶于酸性洗滌劑的結構性碳水化合物，主要包含纖維素和木質素等。與CK組和E組相比，L組和LE組的ADF含量在整個青貯期間顯著增加（<0.05）。有報道認為，植物乳桿菌自身降解CL的能力較弱，而且在植物乳桿菌的影響下纖維素酶不能有效發揮對CL的降解作用，致使L組和LE組中的ADF含量升高[30]。NDF包括酸性洗滌木質素、纖維素和半纖維素等組分，其中半纖維素（HC）是較容易降解的組分之一，在酸性青貯條件下更易被降解[31]。L組和LE組在添加植物乳桿菌后，乳酸協同其他有機酸形成的低pH環境強化了對HC的降解作用，使L組和LE組的NDF和HC含量顯著低于CK組和E組（<0.05）。青貯21 d時，E組在纖維素酶和木聚糖酶的共同作用下有效破壞了木質纖維的致密結構，強化了CL的降解效果，使其CL含量顯著低于CK組（<0.05）。HC和CL組分含量的同時下降，使3個添加劑組在14 和21 d時的NDF和HoC含量顯著低于CK組（<0.05）。ADL組分一般通過共價鍵、酯鍵和氫鍵與纖維素、半纖維素緊密結合，不僅自身較難被降解，而且也是結構性碳水化合物降解的主要屏障。整個青貯期間，4個試驗組中的ADL含量均顯著高于未青貯原料（<0.05），且CK組和LE組中ADL含量呈現先升高后下降趨勢，二者在14 d時達到最高值，而L組和E組則呈現顯著升高趨勢，這種變化趨勢致使青貯21 d時的L組中ADL含量顯著高于CK組（<0.05），但LE組和E組與CK組之間沒有顯著差異（>0.05）。這與GUO等[32]報道在玉米/青稞混合青貯中添加酶制劑（纖維素酶和木聚糖酶）和菌酶（植物乳桿菌、纖維素酶和木聚糖酶）之后的ADL含量顯著上升結果相一致。總之，添加植物乳桿菌和纖維復合酶有利于HC的降解，并有效保存CL含量，青貯預處理能為后續的酶解糖化反應提供充足的能量組分。

表1 青貯預處理過程中木質纖維組分的變化

注：不同大寫字母表示相同處理組不同時間差異顯著（<0.05）；不同小寫字母表示相同時間不同處理組差異顯著（<0.05）。*<0.05，影響顯著；**<0.01，影響高度顯著；***<0.001，影響極顯著。下同。

Note: Different capital letters indicated significant difference between the same treatments at different time (<0.05); Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments at the same time (<0.05). *<0.05, significant effects; **<0.01，very significant effects; ***<0.001, extremely significant effects. The same below.

2.3 青貯預處理過程的發酵品質變化

2.3.1 pH值

pH 值是衡量青貯發酵質量優劣的重要指標，pH值介于3.8～4.2范圍說明發酵品質相對較好。從圖3可知，由于青貯初期原料表面附著的乳酸菌等有益微生物利用WSC組分大量繁殖并代謝產生乳酸（pKa=3.86）和乙酸（pKa= 4.75）等有機酸[33]，使得4個試驗組在7 d時的pH值均快速下降至4.2以下（3.83～4.15）。尤其乳酸對pH值的影響強度是乙酸的12倍，是pH值下降的主要驅動因素[33]。青貯7 d時，L組和LE組的pH值明顯低于CK組和E組（<0.05），說明植物乳桿菌添加后強化了青貯體系中的乳酸發酵，使青貯pH值低于其它試驗組，這一點與表2中乳酸含量變化趨勢相一致。青貯14和21 d時，盡管L組和LE組的pH值均高于CK對照組，但仍低于優良青貯范圍（<4.2）。這可能是因為青貯體系中的腸桿菌等微生物菌群能將乳酸代謝轉化為乙酸；而且LE組在21 d時有較高含量的氨氮物質（圖4），對體系pH值下降也有一定的緩沖能力，這些因素都可能是造成其較高pH值的原因[34]。

圖3 青貯預處理過程中的pH值變化

2.3.2 氨態氮含量

氨態氮含量反映了青貯過程中蛋白質和氨基酸的分解程度，氨態氮含量越高說明分解越多，意味著發酵品質變差，當超出閾值7%時即認為腐敗變質[35]。由圖4可知，青貯甜高粱渣中的氨氮含量均顯著高于原料（<0.05），且CK組、L組和E組隨時間延長呈現先升高后下降趨勢，在14 d時達到最高值；LE組則總體呈現增加趨勢，在21 d時達到最高。所有試驗組的氨態氮含量均低于腐敗變質的閾值7%，說明本試驗中甜高粱渣青貯過程中的蛋白質分解程度較低，青貯品質良好。這可能是因為青貯發酵進程使體系pH值快速下降，有效抑制了植物蛋白酶或有害微生物活性所致[9,33]。青貯21 d時，L組和E組的AN含量顯著低于CK組（<0.05），說明纖維復合酶和植物乳桿菌的添加有助于減少蛋白分解。同時，E組的氨態氮含量在整個青貯期間均顯著低于CK組（<0.05），L組在14和21 d時也顯著低于CK組（<0.05）。說明青貯過程中加入纖維素酶或植物乳桿菌能不同程度地促進青貯乳酸發酵，強化對梭狀芽孢桿菌等腐敗菌和植物蛋白酶活性的抑制作用，進而減少蛋白質的分解[36]。

2.3.3 青貯微生物菌群的代謝產物

小分子有機酸是青貯微生物菌群的主要代謝產物。由表2可知，發酵時間、添加劑及其交互作用對青貯發酵產物的構成及其含量均有極顯著影響（<0.001）。具體地，4個試驗組LA含量均顯著高于原料（<0.05），且隨著青貯周期延長總體呈現先升高后下降趨勢，其中L組和LE組在7 d時達到最高值，CK組和E組在14 d達到最高值。說明青貯預處理過程中的微生物菌群代謝產生了一定量的乳酸[5]，而且加入植物乳桿菌作為添加劑更有助于乳酸菌群的快速繁殖和乳酸生成，進而促進乳酸含量快速累積[28]。另一方面，3個添加劑組的LA含量在整個青貯過程中均顯著高于CK組（<0.05），這與XU等[37]研究結果一致。說明不僅植物乳桿菌能有效促進乳酸積累，添加纖維復合酶也有同樣效果，因為甜高粱渣在纖維復合酶的作用下，纖維素和半纖維素等結構性碳水化合物組分會發生一定程度地降解，從而釋放更多可溶性糖，為青貯過程中的乳酸菌發酵提供了充足底物，促進了乳酸菌群代謝[6]。

圖4 青貯預處理過程中氨態氮含量動態變化

表2 青貯預處理過程中有機酸含量的變化

注：有機酸為乳酸、乙酸和丙酸之和。

ote: Total organic acids are the sum of lactic acid, acetic acid and propionic acid.

乙酸是青貯過程中常見的有機酸，是一種良好的酸化劑和防腐劑，可以有效抑制霉菌和酵母菌生長，提高有氧穩定性。優質青貯的乙酸含量（DM）一般為1～3%[33]。由表2可知，CK組和E組的乙酸含量隨時間延長呈現先升高后下降的趨勢，二者均在14 d達到最高值；L組和LE組的乙酸含量則隨時間延長呈現顯著增加趨勢，且L組在整個青貯期間始終高于CK組（<0.05）。青貯7 d時體系中的乙酸含量迅速增加，原因可能是明串珠菌、魏斯氏菌等異型乳酸發酵菌的相對豐度顯著增加，代謝產生乙酸所致[38]，這與圖9結果相吻合。青貯21 d時，L組和LE組在青貯后期的高乙酸含量可能與厭氧環境中腸桿菌群將體系中的WSC和LA轉化為乙酸、丙酸等物質有關[34]。丙酸也是一種短鏈脂肪酸，有助于提高青貯有氧穩定性。試驗中的丙酸含量均很低，最高含量僅為0.54 g/kg DM，處于良好青貯范圍（<0.1%DM）[33]。整個青貯過程中均未檢測出丁酸，說明沒有梭狀芽孢桿菌等典型的丁酸腐敗菌[14]。

乳酸、乙酸等有機酸的聯動變化使4個試驗組的乳酸/乙酸（LA/AA）和乳酸/總有機酸（LA/TOA）比值均顯著高于原料（<0.05），且呈現先升高后下降的趨勢，并在7 d時均達到最高值。研究表明，LA/AA比值反映了青貯過程的乳酸發酵模式，LA/AA比值高于2.0一般被認為是同型乳酸發酵[39]。4個試驗組在21 d青貯期間的LA/AA值始終大于2.0，LA/TOA值始終高于0.65，說明4個試驗組均以同型乳酸發酵為主，具有良好的乳酸發酵強度，也達到了優良青貯范疇[40]。這與USMAN等[9]報道的甜高粱青貯中添加植物乳桿菌的作用效果一致。尤其E組的LA/AA和LA/TOA比值在21 d青貯期間始終明顯高于其他試驗組（<0.05），說明纖維復合酶的加入強化了青貯過程的乳酸發酵強度。FOSTER等[29]在高粱青貯中添加纖維復合酶（纖維素酶和木聚糖酶）也發現有類似效果。

2.3.4 青貯預處理過程中各指標參數的相關性分析

由圖5可知，青貯7 d時，甜高粱渣中的WSC含量與CP含量呈顯著正相關（<0.05），與ADL含量呈顯著負相關（<0.05），相關系數分別為0.95、0.96。青貯pH值與ADF和CL含量呈顯著負相關（<0.05），相關系數分別為0.99、0.98。青貯14 d時，甜高粱渣中的NDF含量與HC含量呈顯著正相關（<0.05），CL含量與ADF含量呈顯著正相關（<0.05），相關系數分別為0.88、0.99。青貯21 d時，甜高粱渣中的NDF含量和Hoc含量呈顯著正相關（<0.05），相關系數為0.99，Hoc含量與ST、NDF呈顯著正相關關系（<0.05）相關系數分別為0.98和0.99，與CP、ADL呈顯著負相關關系，相關系數分別為0.96和0.97。在青貯前期，原料附著乳酸菌利用豐富的WSC作為代謝底物，大量繁殖并產生LA等有機酸，降低青貯pH值，抑制了植物蛋白酶和梭菌等蛋白分解菌，有效保存了CP組分（圖2 a）。隨著青貯發酵的正向發展，青貯過程蘊藏的生化預處理作用進一步促進了木質纖維組分的優化重組，這些變化將對甜高粱渣的降解性能起到積極促進作用[12,41]。

圖5 青貯預處理過程中各指標之間的相關性分析

2.3.5 基于隸屬函數法的青貯質量綜合評價

利用隸屬函數法對甜高粱渣的青貯質量進行綜合評價，其中DM、CP、LA、ST、NDF為正向指標，pH值、ADF和AN含量為負向指標，綜合評價值越高說明質量越好。由圖6可知，青貯21 d時E組的平均隸屬值為0.78，其次是CK組（0.62）、L組（0.56）和LE組（0.39）；在7和14 d時E組的平均隸屬函數值也相對較高。綜合判定，青貯過程中單獨添加纖維復合酶有利于提高甜高粱渣的青貯質量。

2.4 青貯預處理過程中的細菌菌群多樣性分析

2.4.1 Alpha 多樣性指數

青貯過程中的細菌菌群變化與發酵產物的生成以及有機組分變化息息相關，特別是優勢細菌種群將直接影響青貯品質。覆蓋率數值反映樣本檢測質量，數值越高說明樣本中物種被測出的概率越高。試驗中，所有青貯樣本Reads范圍60 909～76 467，覆蓋率均大于0.99，說明測序結果能充分反映細菌菌群的真實情況。

注：綜合價值為各正負隸屬函數值和的平均值。

Chao1和ACE指數表示群落物種的豐富度，其值隨著群落物種豐富度的升高而增大；Shannon指數表示群落物種的多樣性，其值隨著菌群多樣性的上升而增加[14]。由圖7可知，在青貯7 和14 d時，CK組和E組的Chao1和ACE指數與CK組相比無顯著性差異（>0.05）；青貯21 d時，3個添加劑組均顯著低于CK組（<0.05）。就Shannon指數而言，隨著青貯周期的延長CK組呈現持續上升趨勢，L組和CK組則呈現先上升后下降趨勢，LE組呈現“上升-下降-上升”趨勢。可見，3個添加劑青貯組中的細菌菌群豐富度和多樣性均顯著下降，說明添加劑能有效調控青貯發酵體系中的細菌菌群豐富度，通過有益乳酸菌群的發酵繁殖降低pH值，抑制梭狀芽胞桿菌等不良微生物繁殖，降低細菌多樣性，對獲得良好青貯品質起到重要作用。PUNTILLO等[42]發現在高粱青貯過程中加入包含植物乳桿菌的復合乳酸菌劑能顯著降低細菌種群的豐富度和多樣性。DONG等[12]在甜高粱渣青貯過程中也發現有類似結果。

總之，相較于CK組而言，添加植物乳桿菌、纖維復合酶或二者聯合添加均能有效降低青貯體系中的細菌菌群豐富度和多樣性。

a. ACE 指數 a. ACE indexb. Chao1指數 b. Chao1 indexc. Shannon 指數 c. Shannon index

2.4.2 主坐標分析

PCA分析是一種探索和可視化細菌菌群異同性的方法，2個樣本點之間的距離越近，說明細菌菌群結構相似度越高[28]。由圖 8所示，新鮮甜高粱渣樣品與青貯樣品之間分離明顯，這與ZHANG等[5]報道的青貯高粱稈的細菌聚類與原料顯著分離結果一致。另一方面，隨著青貯時間的變化，不同添加劑對細菌菌群構成的影響也存在差異。其中，不同青貯時期的CK組樣品聚集較為明顯，L組（14和21 d）和LE組（7和14 d）的青貯樣品也存在明顯聚集，E組的青貯樣品則較為分散。青貯21 d時E組和LE組樣品的細菌菌群與CK組相近。

注：SSB為甜高粱渣。

2.4.3 門分類水平細菌群落組成

由圖9a可知，甜高粱渣原料表面附著的門水平優勢細菌主要是變形菌（Proteobacteria，90.87%）和少量厚壁菌（Firmicutes，4.48%）、擬桿菌（Bacteroidetes，1.55%）、藍細菌（Cyanobacteria，0.89%）。青貯發酵后，4個試驗組的細菌群落仍以變形菌為主，但厚壁菌相對豐度有明顯提升，說明在厭氧酸性青貯環境中厚壁菌能快速適應并生長繁殖[5]。其中，L組的厚壁菌相對豐度隨時間延長呈現先上升后下降趨勢，E組和LE組則呈現上升趨勢并維持較高水平。說明添加纖維復合酶能形成有利于維持厚壁菌生長代謝的微生態環境[28]。

2.4.4 屬分類水平細菌群落組成

如圖9b所示，甜高粱渣原料表面附著的屬水平細菌主要有泛菌（，48.72%）、腸桿菌（，37.65%）和少量拉恩氏菌（，3.34%）、葡糖桿菌（，1.44%）、明串珠菌（，1.24%）、乳桿菌（，1.18%）等。DONG等[12]也報道發現甜高粱渣原料中的優勢菌群為泛菌（39%）。青貯21 d時，4個試驗組的乳酸細菌（以明串珠菌為主）總豐度從原料的2.86%分別升至13.28%（CK組）、11.58%（L組）、12.54%（E組）和13.56%（LE組），但仍未占據主導優勢。這可能是因為原料表面自身附著的乳酸細菌較少，且青貯時間相對較短，乳酸菌群尚未能充分生長繁殖。與此同時，4個青貯組在21 d時的泛菌相對豐度分別降至22.14%（CK組）、21.61%（L組）、19.14%（E組）和24.1%（LE組），這與DONG等[12]的研究結果類似。OGUNADE等[43]認為泛菌能抑制梭狀芽孢桿菌生長，進而降低青貯中的氨氮含量，這也可能是4個試驗組中氨氮含量維持在良好閾值范圍的原因之一。

圖9 青貯預處理過程中的門水平和屬水平的細菌菌群多樣性

就腸桿菌群而言，CK組在青貯21 d時的相對豐度降至36.26%，3個添加劑組則分別升至60.64%（L組）、46.18%（E組）和44.24%（LE組）。DONG等[12]也發現青貯甜高粱渣的腸桿菌相對豐度由原料中不足5%增至20%以上。研究表明，腸桿菌群可以在厭氧和弱酸性環境中生長繁殖，并與乳酸細菌競爭發酵底物，將乳酸和WSC轉化為乙酸、琥珀酸、乙醇或2,3-丁二醇，導致營養物質的損失[34]。相較于CK組，3個添加劑組中的腸桿菌相對豐度均顯著升高，其原因可能是在植物乳桿菌和纖維復合酶的作用下，體系內可利用的WSC含量升高，進而促進了腸桿菌的生長繁殖，使其相對豐度提高。但由于腸桿菌也能代謝產生一定量的有機酸，故尚未對青貯發酵品質形成不良影響。

2.5 添加劑對甜高粱渣青貯預處理作用的強化效果

由圖10可知，4個青貯組的甜高粱渣還原糖得率均顯著高于原料（<0.05），酶解糖化72 h的還原糖得率分別比原料提高了116%（CK組）、77%（L組）、117%（E組）和107%（LE組）。其中E組的青貯預處理效果最好，還原糖得率高達888.56 mg/g，明顯高于MISHRA等[44]報道的使用多種真菌混合預處理甜高粱渣后的還原糖得率750 mg/g，也高于CAO等[45]使用20%的NaOH溶液預處理甜高粱渣后的還原糖得率696.1 mg/g。說明青貯發酵能有效強化甜高粱渣的生物降解效果，這可能是因為青貯過程的酸性環境和有機酸組分能打破木質素和半纖維素的屏障作用，增加纖維素對水解酶的可及面積，進而釋放出較多的可發酵糖[6]。青貯過程中微生物菌群的協同作用也是促進木質纖維組分降解的原因之一。另一方面，添加纖維復合酶有助于解聚原先緊密的木質纖維抗降解屏障結構，促進纖維素和半纖維素分解，進而提高纖維素可及面積和降解機率，使其更容易在糖化過程中被生物酶作用分解，強化青貯過程中的預處理作用，提高甜高粱渣的生物降解性能[46]。

注：CK、L、E和LE為青貯21 d樣品。各組從左至右酶解時間分別為12、24、36、48、60和72 h。

2.6 不同添加劑強化青貯預處理的經濟效益分析

由表3可知，甜高粱渣經過青貯預處理后獲得還原糖的綜合理論經濟收益遠高于原料（SSB組212元/t），說明青貯預處理能有效提高甜高粱渣的利用效率，創造更高的經濟收益。而且，不同預處理方式的純收益差異也較為明顯，由高到低順序依次為E組836元/t、CK組818元/t、LE組686元/t和L組575元/t。其中，采用纖維復合酶進行強化青貯預處理的還原糖收益最高。結合圖10中的酶解糖化降解效果分析，建議實際生產中選擇添加纖維復合酶進行青貯預處理，該方法具有成本收益和技術高效的雙重優勢。

表3 青貯預處理前后的經濟收益分析

注：計算基準為1 t甜高粱渣原料，還原糖售價參考99%純度葡萄糖（4 520元/t），總收益=還原糖質量×還原糖售價，單位糖化成本為1 300元/t，糖化成本=干基質量×單位糖化成本，總成本=原料成本+青貯成本+糖化成本，純收益=總收益-總成本[20]。

Note: The calculation basis was 1 t of sweet sorghum bagasse. The selling price of reducing sugar was based on 99% pure glucose (4 520 Yuan·t-1). Gross income = reducing sugar mass×reducing sugar price. Unit saccharification cost is 1 300 Yuan·t-1. Saccharification cost = dry base mass × unit saccharification cost. Total cost = SSB cost +ensiling cost+ saccharification cost. Net income= gross income-total cost.

3 結 論

1）單獨或復合添加植物乳桿菌、纖維復合酶，不僅能有效促進青貯預處理過程的乳酸發酵，提高乳酸和乙酸含量，使青貯pH值降至4.2以下，乳酸/乙酸比值>2.0，乳酸占/總有機酸>0.65，而且有助于保存粗蛋白、可溶性碳水化合物等能量組分，優化重組木質纖維組分，瓦解生物降解結構屏障，起到一定的青貯預處理作用。

2）青貯21 d時，3個添加劑青貯組的ACE指數、Chao1指數和Shannon數值均顯著低于CK組（<0.05）。說明加入添加劑有利于降低細菌群落豐富度和多樣性，優化青貯微生物菌群結構，進而調控青貯發酵品質和預處理效果。

3）甜高粱渣經過21 d的青貯預處理作用后，酶解糖化的還原糖得率明顯高于未青貯原料，且3種添加劑的青貯預處理作用都得到不同程度地強化。尤其添加纖維復合酶的青貯甜高粱渣的糖化得率高達888.56 mg/g，青貯預處理作用的強化效果最佳。

4）添加纖維復合酶能明顯降低甜高粱渣青貯預處理過程中的干物質損耗，強化生物酶解糖化效果。每噸甜高粱渣的可發酵糖純收益與未青貯原料相比有所提高，也遠高于其他預處理添加劑。

綜合青貯發酵質量、酶解糖化結果和成本收益等分析結果，推薦選擇纖維復合酶作為甜高粱渣青貯預處理過程的強化劑，這種通過添加劑來強化青貯預處理的策略可以應用于甜高粱渣的能源化利用工程實際中。

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Improvement for the ensiling pretreatment effectiveness of sweet sorghum bagasse by fortified withand cellulolytic enzymes

REN Haiwei1,2,3, SHI Ruifeng1, WEI Huiyuan1, WANG Li1, GUO Xiaopeng1, LU Dong4, LIU Ruiyuan4, LI Jinping2,3※

(1.,,730050,;2.,,730050,;3.-,730050,; 4.,,730050,)

Sweet sorghum bagasse (SSB) is the resultant waste after extraction of sugar-rich juice from the stalks during bioethanol production. As a typical biomass, the SSB consists of moisture, unspent soluble sugar, and abundant lignocellulosic component (cellulose, hemicelluloses and lignin). Theundisposed SSB can inevitably cause the environmental pollution and resource waste. Hence, the effective storage of SSB is necessary for the year-round stable operation of biofuel plants. Among them, ensiling (wet storage) can be an efficient technology available for the SSB preservation and utilization, which enable the SSB to be processed all year around. Moreover, ensiling can also act as a pretreatment strategy, due to the benefits for the cell wall degradation and the improvement of biomass bioconversion for subsequent processing. In this study, the potential of ensiling pretreatment was investigated to fortify withinoculant and cellulolytic enzymes on the improvement of ensiling quality to modulate the performance of enzymatic saccharification of SSB. The SSB were ensiled with no additives (CK),(L), cellulolytic enzyme (E), and a combination of L and E (LE) for 21 days. The dynamic changes of nutrient composition, lignocellulosic components, and ensiling fermentation characteristics were investigated, and then dynamic evolution of the bacterial community structure was analyzed by high-throughput sequencing at HiSeq2500 platform. Ensiling quality was comprehensively evaluated by membership function method, in order to screen the suitable silages additives in consideration of enzymatic hydrolysis performance. The results showed that the addition ofinoculant and cellulolytic enzymes either alone or in combination was facilitated the lactic acid fermentation to reduce the fermentation losses, as evidenced by the higher content of crude protein, starch, neutral detergent fiber, acid detergent fiber, hemicellulose and cellulose components than that of un-ensiled SSB. The content of dry matter, crude protein and water-soluble carbohydrates in silages with additives were higher than those in the CK, but the content of holocellulose lower. Furthermore, the content of dry matter in the E silages, the content of crude protein in the L silages, and the content of water-soluble carbohydrates in the LE silages were the highest in all silages, respectively. The pH value of all silages significantly decreased to below 4.2, accompanied by the ratio of lactic Acid (LA) and total organic acids (TOA) higher than 0.65 and the ratio of lactic acid (LA) and acetic acid (AA) higher than 2 during the whole ensiling for 21 days. The content of LA and AA in the L silages were significantly higher than those of silages at the CK (<0.05), the ratio of LA/TOA and LA/AA in the E silages were significantly higher than those of silages at the CK(<0.05). The membership function analysis indicated that the silages at the E group shared the highest comprehensive scores at 21 days. The bacterial community structure showed that thewas the main bacteria in all silages during ensiling fermentation. At 21 days of ensilage,andwere the main species in the silages at genus level. ACE, Chao1 and Shannon index in the E, L and LE silages were significantly lower than those of CK group (<0.05). It infers that the ensiling pretreatment with the additives was effectively reduced the microbial richness and diversity. Principal Coordinate Analysis (PCA) was constructed using the relative abundance of bacteria at the genus level, indicating the outstanding separation in the SSB before and after ensiling pretreatment. After ensiling pretreatment, the yield of reducing sugar in all SSB silages significantly increased, compared with the un-ensiled SSB. Consequently, the reducing sugar yield in the E silages increased by 117%. The highest net income of E silages fortified with cellulolytic enzyme was almost three-fold that of un-ensiled SSB using cost-benefit analysis. In conclusion, the ensiling pretreatment fortified by cellulolytic enzymes can be expected to serve as a cost-effective, eco-friendly and tech-feasible strategy for the preservation and pretreatment of SSB biomass. Especially, cellulolytic enzyme can be used to modulate the ensiling pretreatment performance. Therefore, the ensiling quality and the biodegradation performance of SSB silage can be effectively improved for the bioenergy utilization of sweet sorghum bagasse.

ensiling； fermentation;; cellulolytic enzyme; sweet sorghum bagasse; microbial community; enzymatic saccharification

10.11975/j.issn.1002-6819.202211017

S21；S126.4

A

1002-6819(2023)-06-0224-13

任海偉，石瑞鋒，魏慧元，等. 菌/酶添加對甜高粱渣青貯預處理作用的強化效果[J]. 農業工程學報，2023，39(6)：224-236.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202211017 http://www.tcsae.org

REN Haiwei, SHI Ruifeng, WEI Huiyuan, et al. Improvement for the ensiling pretreatment effectiveness of sweet sorghum bagasse by fortified withand cellulolytic enzymes[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(6): 224-236. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202211017 http://www.tcsae.org

2022-11-02

2022-03-05

國家自然科學基金項目（5166010）；甘肅省自然科學基金重點項目（21JR7RA203）；中國博士后科學基金項目（2019T120961）；蘭州理工大學紅柳杰出青年支持計劃（JQ2020）；蘭州理工大學紅柳一流交叉學科計劃（0807J1）和甘肅省研究生“創新之星”項目（2023CXZX-500）資助

任海偉，教授，博士生導師，研究方向為生物質資源轉化。Email：rhw52571119@163.com

李金平，教授，博士生導師，研究方向為先進可再生能源系統。Email：lijinpijng77@163.com

中國農業工程學會高級會員: 任海偉（E041200735S）