微小RNA-195通過靶向抑制PH結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2表達(dá)參與香煙煙霧誘導(dǎo)急性肺損傷機(jī)制研究

梁艷均,吳桂全,漆 勇,李 靜

(川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院 三臺(tái)縣人民醫(yī)院,四川 三臺(tái) 621100)

隨著近些年我國(guó)環(huán)境污染的加重,各類呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì),慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一類以氣流阻塞為典型癥狀的疾病,患者主要臨床表現(xiàn)為以氣流阻塞為特征的氣管炎癥和肺氣腫,如未得到及時(shí)干預(yù)可能會(huì)發(fā)展為肺心病或呼吸衰竭,COPD具有較高的致殘率和病死率,全球40歲以上發(fā)病率現(xiàn)已高達(dá)9%～10%[1-3]。研究[4]指出,COPD的發(fā)病機(jī)制尚不清晰,但該病的發(fā)生與多種因素有關(guān),吸煙、空氣污染、病毒感染、基因多態(tài)性、性別、年齡等均與該病的發(fā)生存在密切聯(lián)系。研究[5]指出,吸入香煙煙霧是導(dǎo)致COPD的最主要因素之一。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),香煙煙霧會(huì)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生并直接導(dǎo)致肺組織的損害,對(duì)COPD發(fā)病機(jī)制的探究對(duì)針對(duì)性制訂防治策略具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)約18～22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA,此類RNA能夠通過靶向與某些位點(diǎn)的結(jié)合,對(duì)靶蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響,進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、能量代謝等生理功能[6]。miR-195目前發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種病變中呈現(xiàn)高表達(dá)態(tài)[7]。本研究通過探究miR-195靶向抑制PH結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2(PH domain leucineme-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2)參與香煙煙霧誘導(dǎo)急性肺損傷的機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇健康清潔級(jí)小鼠90只,體重20～26 g,平均(22.36±2.01)g,購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心,許可證號(hào)SYXK(京)2014-0040。所有動(dòng)物均于21～24 ℃的光照-暗循環(huán)12 h條件下實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng),本次實(shí)驗(yàn)所有操作和流程均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。②其他材料:小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)ml002095、ml063162、ml037717、ml002070、ml643059、ml643115)。光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯(型號(hào)BX53P)。

1.2 研究方法 將所有小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組,每組各30只。將A組小鼠作為正常對(duì)照組,B組小鼠作為低劑量干預(yù)組,C組小鼠作為高劑量干預(yù)組。對(duì)B、C兩組小鼠依據(jù)以往報(bào)道的方法[8]建立香煙煙霧誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型,其中B組小鼠暴露于5支香煙煙霧條件下,4次/d,每次間隔30 min不吸煙,5 d/周,共干預(yù)15周;C組小鼠暴露于10支香煙煙霧條件下,4次/d,每次間隔30 min不吸煙,5 d/周,共干預(yù)15周;當(dāng)兩組小鼠肺部出現(xiàn)炎性反應(yīng),且病理檢查發(fā)現(xiàn)滲出性肺水腫則說明建模成功。A組小鼠不實(shí)施任何干預(yù),暴露于常規(guī)空氣環(huán)境中。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 小鼠肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞因子水平檢測(cè):于末次暴露于香煙煙霧后18 h處死小鼠,分離其氣道進(jìn)行插管,結(jié)扎左肺并實(shí)施肺泡灌注,取灌注液采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)灌注液中 TNF-α、IL-8及MMP-9水平,注意操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)3次,取平均值作最終值。

1.3.2 小鼠肺泡灌注液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù):取50 μl肺泡灌注液加入同等體積的白細(xì)胞計(jì)數(shù)液,于100倍光鏡下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察,同時(shí)取肺泡灌注液離心后留沉淀做細(xì)胞涂片,室溫下干燥后染色,400倍光鏡下觀察細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.3.3 小鼠肺泡灌注液過氧化物質(zhì)水平檢測(cè):取三組小鼠肺組織,制作成為5%的肺勻漿,使用試劑盒檢測(cè)上層清液中MPO、SOD、GSH水平,并進(jìn)行組間對(duì)比。

1.3.4 小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達(dá)檢測(cè):取三組小鼠肺組織勻漿,提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用RT-PCR的方法測(cè)定肺勻漿中miR-195表達(dá)情況;選擇小鼠肺組織于-80 ℃條件下冰凍,取出后在液氮中研磨為粉末狀,加入裂解液制備組織勻漿,而后使用Westtern blot法檢測(cè)PHLPP2蛋白表達(dá)量,并進(jìn)行組間對(duì)比。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞因子水平對(duì)比 C組TNF-α、IL-8及MMP-9水平均高于B組,B組均高于A組,同時(shí)組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1。

表1 三組小鼠肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞因子水平對(duì)比

2.2 三組小鼠肺泡灌注液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比 C組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞均高于B組,B組均高于A組,組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

表2 三組小鼠肺泡灌注液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比(102/mm3)

2.3 三組小鼠肺泡灌洗液過氧化標(biāo)志物水平對(duì)比 C組MPO、SOD、GSH水平高于B組,B組高于A組,組間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表3。

表3 三組小鼠肺泡灌洗液過氧化標(biāo)志物水平對(duì)比

2.4 三組小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達(dá)量對(duì)比 miR-195表達(dá)C組>B組>A組,PHLPP2蛋白表達(dá)C組

表4 三組小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達(dá)量對(duì)比

3 討 論

COPD是一種不完全可逆的以氣流受限為典型臨床特征的疾病,患者的氣流受限常呈進(jìn)行性發(fā)展,具體可分為慢性支氣管炎和肺氣腫兩種疾病。流調(diào)學(xué)顯示,COPD居目前全球發(fā)病率第12位和死因第4位,有學(xué)者預(yù)計(jì)到2020年,COPD將成為僅次于冠心病和心腦血管疾病的第5位致殘和第3位致死疾病[9]。資料[10]表明,在美國(guó)COPD位居第4位致死原因,在歐盟居第3位,在我國(guó)COPD居第4位。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)一項(xiàng)調(diào)研顯示,全球COPD患病率約為0.8%,臨床實(shí)踐指出,COPD危險(xiǎn)因素包括吸煙、空氣污染、營(yíng)養(yǎng)、遺傳等,在上述因素中,吸煙被認(rèn)為是COPD最危險(xiǎn)因素,約有10%～15%的人會(huì)罹患COPD,因而對(duì)吸煙如何誘導(dǎo)肺損傷機(jī)制的探究是改善COPD患者生活質(zhì)量的重要途徑之一[11]。

隨著近些年分子生物技術(shù)的發(fā)展,miRNA在腫瘤及其他疾病中所發(fā)揮的作用逐漸被發(fā)掘出來,對(duì)miRNA的研究成為探究腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、治療等進(jìn)程的重要手段。miR-195位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,在以往的研究中,有多項(xiàng)研究證實(shí)該基因與多種癌癥進(jìn)程存在密切聯(lián)系。張文昭等[12]通過將54例早期乳腺癌患者、58例良性乳腺癌患者及70例健康女性進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),早期乳腺癌患者血清中miR-195表達(dá)量明顯高于良性乳腺疾病組及健康對(duì)照組女性,同時(shí)經(jīng)工作特征曲線分析顯示,miR-195歲早期乳腺癌診斷敏感度為70.0%,特異度為93.3%;王依等[13]則通過體外培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn),miR-195對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)、凋亡及遷移等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,分析其原因?yàn)閙iR-195能夠通過靶向調(diào)控MYB基因來抑制A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)和遷移,促進(jìn)其凋亡。PHLPP目前被發(fā)現(xiàn)能夠通過使Akt、蛋白激酶C及S6激酶相應(yīng)保守位點(diǎn)去磷酸化來促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖,PHLPP2是PHLPP的一類。何曉燕等[14]通過將40例食管上皮內(nèi)瘤變與63例食管鱗癌患者進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),良性病變患者組織中PHLPP2表達(dá)水平明顯高于食管鱗癌患者,而良性病變患者與正常對(duì)照組組織中水平對(duì)比差異并不明顯,進(jìn)一步分析顯示PHLPP2還與食管鱗癌患者TNM分期有密切相關(guān)性,提示該蛋白可以作為食管鱗癌診斷指標(biāo)之一。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方式,就miR-195通過靶向PHLPP2來參與香煙煙霧誘導(dǎo)肺損傷進(jìn)程進(jìn)行了探究,結(jié)果顯示,使用香煙煙霧進(jìn)行干預(yù)的B組及C組小鼠其肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-8及MMP-9水平明顯高于空氣干預(yù)的A組小鼠,同時(shí)B、C兩組小鼠其白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)也明顯升高,MPO、SOD、GSH等過氧化物指標(biāo)水平也有提升,分析認(rèn)為,煙霧誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織出現(xiàn)急性炎性反應(yīng),其機(jī)制為煙霧能夠激活上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞使其釋放趨化因子從而吸引炎癥細(xì)胞進(jìn)入肺部[15-17]。最后本研究結(jié)果還提示,B、C兩組小鼠其肺組織中miR-195表達(dá)量明顯高于A組小鼠,PHLPP2表達(dá)量明顯低于A組小鼠,分析認(rèn)為,PHLPP2能夠通過去磷酸化使Akt失活,從而抑制細(xì)胞的凋亡,本研究中PHLPP2屬于miR-195的靶點(diǎn),miR-195的過表達(dá)能夠下調(diào)PHLPP2的水平,進(jìn)而提高了Akt在細(xì)胞中的磷酸化水平,通過正調(diào)控Akt磷酸化,從而加快肺泡細(xì)胞的凋亡,加重肺組織的炎性反應(yīng)和損傷進(jìn)程[18-20]。

綜上所述,香煙煙霧能夠誘導(dǎo)小鼠肺組織出現(xiàn)炎性改變,分析其原因與miR-195過表達(dá)并抑制PHLPP2蛋白表達(dá)有關(guān)。