丹參素通過STAT3/JAK2/SOCS1信號通路在妊娠期糖尿病干預中的作用機制研究

魏小敏,王麗麗,劉海霞,楊玉俠,宋志慧

(唐山市婦幼保健院產科,河北 唐山063000)

妊娠期糖尿病是在妊娠期發生的糖尿病,中國發生率約為1%～5%。妊娠期糖尿病主要是由于妊娠期母體發生了一系列生理變化。孕期腎血漿流量及腎小球濾過率均增加,孕婦體內拮抗胰島素的物質增多,使得孕婦機體對胰島素的敏感性隨孕周增加而下降[1-5]。丹參素是丹參中水溶性有效成分,研究表明其具降血脂、降尿酸、神經保護、防治肝纖維化及抗腫瘤、抗炎等作用[6-8],但妊娠期糖尿病的治療作用尚不清晰,因此通過動物學實驗探究其作用對臨床治療具有指導價值。STAT3/JAK2/SOCS1通路激活對于細胞增殖和轉化起到極為重要作用,受到細胞因子和生長因子刺激后,STAT3被JAK激活,Ser727或Tyr705位點磷酸化,進入細胞核發揮轉錄調控作用,參與細胞的生長與凋亡,其異常活化與多種疾病相關[9]。研究表明抑制腎小管上皮細胞中的 STAT3可預防鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠的腎纖維化和腎病[10],但是否在妊娠期糖尿病中發揮作用尚不清晰。因此本研究將建立大鼠妊娠期糖尿病模型,用不同濃度的丹參素干預各組大鼠,探究不同濃度的丹參素對妊娠期糖尿病的保護作用,并探究丹參素是否可以影響STAT3/JAK2/SOCS1的表達,為丹參素在臨床妊娠期糖尿病干預中的作用提供分子機制和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 100只10周齡SPF級雌性SD大鼠及50只10周齡SPF級雄性SD大鼠,體重(220±20)g,購于北京隆安實驗動物養殖中心[SYXK(京)2021-0067],溫度22～26 ℃,相對濕度50%～70%,噪音小于80 dB,氨濃度20 ppm 以下,通風換氣12 次/h。本實驗通過唐山市婦幼保健院倫理委員會審核。丹參素購于上海將來實業股份有限公司(貨號76822-21-4)。STZ(貨號18883-464) 購于上海懋康生物科技有限公司。蘇木精(貨號517-28-2)和伊紅(貨號861006)購于美國Sigma 公司。B105臺式高速冷凍離心機購于美國Thermo Biofuge Stratos,全自動生化分析儀快速檢測醫院生化儀器BK-200購于山東博欽儀器儀表有限公司,血糖儀660購于上海YUWELL有限公司,7500qPCR儀器購于美國ABI公司,Western blot電泳儀購于美國Bio-Rad有限公司,超純水系統購于美國Mili Q有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠妊娠期糖尿病模型建立:SD雌性大鼠分別與SD雄性大鼠交配,懷孕后將大鼠分為六組,即對照組、模型組、厄貝沙坦組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組,每組10只。孕鼠于孕期第0天單次腹腔注射STZ 35 mg/kg,于懷孕后第7天測量血糖,成模標準為15～20 mmol/L,成模后分別給予厄貝沙坦[10 mg/(kg·d)]、低[10 mg/(kg·d)]、中[15 mg/(kg·d)]、高[20 mg/(kg·d)]劑量的丹參素灌胃,7 d后大鼠用于各項檢測;對照組孕鼠除注射同體積0.9%氯化鈉溶液外其他操作一致。

1.2.2 HE染色檢測各組大鼠腎臟組織病理情況:從大鼠腎臟上取下組織塊投入預先配好的固定液中(10%甲醛溶液),將包埋好的蠟塊固定于切片機上,切成4 μm厚薄片。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘。置于70%和90%乙醇中脫水各10 min,置入乙醇伊紅染色后脫水,再經二甲苯使切片透明蓋上蓋玻片封固,顯微鏡下觀察(×400)。

1.2.3 各組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白和空腹血糖水平檢測:大鼠經腹腔麻醉后,對各組大鼠進行眼眶采血,每只大鼠1 ml,4 ℃離心 1500 r/min 10 min,分離上清,于生化儀上檢測各組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白,通過血糖分析儀檢測各組大鼠空腹血糖。

1.2.4 qPCR檢測大鼠腎臟組織中STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA表達水平:對腎臟組織樣本在液氮中進行研磨后提取RNA,cDNA逆轉錄嚴格按照試劑盒逆轉錄說明進行,通過qPCR儀對STAT3、JAK2和SOCS1表達水平進行檢測,所有操作在冰上進行并避免RNA酶污染。實時熒光定量PCR的條件為:預變性95 ℃、10 min,變性95 ℃、10 s,退火60 ℃、30 s,延伸72 ℃、40 s,35個循環,以β-actin分別作為內參,以2-△△Ct計算STAT3、JAK2和SOCS1相對表達量,引物序列見表1。

表1 qPCR檢測中不同基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測大鼠腎臟組織中STAT3、JAK2和SOCS1 蛋白表達水平:取適量腎臟組織在液氮中研磨并取總蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度,采用5×SDS的蛋白上樣緩沖液在98 ℃上煮沸10 min后儲存于-80 ℃冰箱備用。實驗時將各樣本加入不同的泳道,濃縮膠電壓80 V、10 min,分離膠電壓110 V、2 h,加入特異性一抗STAT3(1∶2000),JAK2(1∶5000),SOCS1(1∶1000)和β-actin(1∶5000)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次,每次5 min,加入特異性的羊抗兔二抗(1∶1000),孵育1 h。采用ECL化學發光液曝光顯影,使用Chemi Doc Western blot凝膠成像分析系統進行蛋白質成像及定量分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠腎臟組織HE染色比較 見圖1。對照組腎組織細胞排列整齊,細胞界限清晰,無細胞浸潤;模型組組織分散,細胞排列散亂,細胞界限不清晰,并伴有大量細胞浸潤;與模型組相比較,丹參素各組大鼠細胞排列相對整齊,細胞界限相對清晰,細胞浸潤減少,提示其腎組織損傷有所恢復。

2.2 各組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白和空腹血糖水平比較 見表2。與對照組大鼠比較,模型組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白、空腹血糖水平著升高(均P<0.05)。與模型組相比,不同劑量丹參素組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白、空腹血糖水平著顯著降低,但仍高于對照組(均P<0.05),同時具有一定的劑量依賴效應。

表2 各組大鼠血清Scr、BUN、尿蛋白和空腹血糖水平比較

2.3 各組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA表達水平比較 見表3。與對照組大鼠比較,模型組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA表達水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組大鼠相比,不同劑量丹參素組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA顯著降低(均P<0.05),并具有劑量依賴效應。

表3 各組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA表達水平比較

2.4 各組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1蛋白表達水平比較 見表4。與對照組大鼠比較,模型組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組大鼠相比,不同劑量丹參素組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1 蛋白表達顯著降低(均P<0.05),并具有劑量依賴效應。

表4 各組大鼠腎臟組織STAT3、JAK2、SOCS1蛋白表達水平比較

3 討 論

妊娠期糖尿病系指在妊娠期首次發現或發生的糖代謝異常,糖尿病孕婦中80% 以上為妊娠期糖尿病,糖尿病合并妊娠者不足 20%,近年有明顯增高趨勢[11-13]。妊娠與腎病同時存在將導致患者面臨多重挑戰,如腎臟功能的生理需求增加、腎病進展風險、藥物的潛在致畸性、妊娠并發癥(先兆子癇和早產)增加風險[14-15]。丹參素是丹參中水溶性有效成分,具有明顯的藥理活性,在許多生理過程中都可發揮活性作用,如改善微循環、抑制活性氧的產生、抑制血小板的粘連和凝集、在缺血情況下保護心肌,保護內皮細胞免受炎癥帶來的損傷[16-17]。研究表明丹參素通過MEK/ERK 信號通路抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化,減輕博萊霉素誘導的肺纖維化[18],也有研究表明丹參素通過激活小鼠 PKA-CREB 信號通路減輕β-淀粉樣蛋白誘導的小鼠認知障礙[19],但丹參素對妊娠期糖尿病的臨床作用尚不清晰。

本研究通過建立大鼠妊娠期糖尿病模型,并通過給予妊娠期糖尿病大鼠不同劑量丹參素治療,發現丹參素不同濃度處理后大鼠妊娠期糖尿病腎組織損傷降低,并具有一定的劑量效應,提示了丹參素具有一定腎臟組織保護的作用。血糖水平和Scr、BUN、尿蛋白是臨床血糖判斷和腎功能檢測的金標準,因此本研究進一步檢測了不同劑量丹參素組大鼠外周血血糖水平和Scr、BUN、尿蛋白水平,結果表明模型組大鼠血糖水平和Scr、BUN、尿蛋白水平升高,而丹參素組大鼠血糖水平和Scr、BUN、尿蛋白降低,提示出丹參素具有恢復腎臟功能的作用,并且具有降低血糖的作用。本研究從組織水平、血糖水平、腎功能水平證實了丹參素可能降低血糖,提高腎功能,發揮腎臟的保護作用。

STAT3/JAK2/SOCS1通路在相關疾病中發揮重要作用,尤其在機體應對感染、組織損傷或者細胞應激的反應過程中發揮關鍵作用,參與了腎臟修復和功能恢復[20]。研究表明STAT3/JAK2信號通路可以通過SIRT1 硫化通過抑制 p65 NF-κB 的磷酸化和乙酰化來預防糖尿病腎病[15],但在妊娠期糖尿病中的研究較少,因此本研究進一步探究了妊娠期糖尿病過程中STAT3/JAK2/SOCS1的表達變化,結果表明妊娠期糖尿病過程中STAT3/JAK2/SOCS1信號通路發生異常激活,STAT3、JAK2、SOCS1 mRNA及蛋白表達水平均顯著提高,提示出較強的炎性信號激活,而是用丹參素后,各組大鼠腎臟組織中的STAT3、JAK2、SOCS1表達水平均顯著降低,提示丹參素對STAT3/JAK2/SOCS1具有抑制作用,從而發揮組織保護作用。

綜上,本研究證實了丹參素對孕期糖尿病具有保護作用,其機制與抑制腎臟組織中STAT3/JAK2/SOCS1信號通路的異常激活有關。