基于網絡藥理學及分子對接探討益氣活血方治療深靜脈血栓形成的作用機制*

秦曉慧，羅 丹，張 力

1 廣西中醫藥大學研究生院,廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈腔內不正常凝結，阻塞管腔而引起的靜脈回流障礙，多見于大手術或嚴重創傷、長期臥床、肢體制動、腫瘤患者等。DVT 急性期易并發嚴重的致死性肺栓塞，慢性期由于靜脈瓣膜功能受損易發生血栓，危及患者的生命質量與安全［1-2］。目前認為DVT的主要原因是靜脈血流滯緩、靜脈壁損傷和血液高凝狀態［3］，現代醫學治療方法主要有抗凝、溶栓、手術取栓、放置下腔靜脈濾器等［4］。

深靜脈血栓屬中醫學“股腫”“瘀血流注”及“脈痹”等范疇［5］，其病位在血脈，脈絡血瘀貫穿于DVT 的始終［6］。中醫藥治療DVT 具有綜合調控的優勢，中藥組方中多種成分可通過多途徑、多靶點協同發揮復雜生物學作用。益氣活血方是院內制劑，遵《醫林改錯》“氣虛血必瘀”之旨，在血府逐瘀湯的基礎上加減化裁而成。本方由桃仁、紅花、生地黃、川芎、當歸、赤芍、柴胡、枳殼、甘草、黃芪、水蛭、牛膝等藥味組成，有益氣化瘀、活血通脈之效，臨床上用于治療DVT，在溶栓、抗凝、保護血管內膜、減輕血栓形成后炎癥反應等方面收效良好［7-8］，且安全性高，患者依從性好，在臨床治療DVT 中逐漸得到推廣應用［9］。本文基于網絡藥理學的方法，對益氣活血方的有效活性成分及其治療DVT 的潛在作用靶點、信號通路進行預測，并采用分子對接技術進行評估驗證，為益氣活血方后續臨床及實驗研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 益氣活血方活性成分和靶點篩選利用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com），以“黃芪”“甘草”“枳殼”“柴胡”“牛膝”“赤芍”“川芎”“當歸”“生地黃”“紅花”“桃仁”為關鍵詞，進行檢索，設定參數口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18進行初步篩選，獲得相應藥物的有效活性成分；在數據庫中輸入化合物成分，獲得益氣活血方中化合物成分對應的靶點。由于TCMSP數據庫未收錄水蛭，所以以“水蛭”為關鍵詞，通過中藥綜合數據庫（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/）搜集其成分，在Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根據成分名稱查詢相應的InChIKey，將得到的InChIKey通過TCMSP 數據庫進行靶點提取。使用Uniprot蛋白質數據庫（http：//www.uniprot.org），把篩選的靶點規范為人源（Homo sapiens）的標準因，得到其Gene ID作為靶點標準化名稱。

1.2 DVT 相關靶點篩選使用GeneCards 數據庫（https：//www. genecards. org）以“deep vein thrombosis”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病相關靶點。

1.3 益氣活血方-DVT 潛在交集靶點的獲取將收集到的藥物和疾病的相關靶點上傳至Venny2.1在線軟件作圖工具平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），在線得到兩者的交集，作為藥物-疾病潛在交集靶點。

1.4 潛在交集靶點的相互作用網絡構建及分析將“1.3”項所得的潛在交集靶點輸入到STRING 數據庫（https：//www.string-db.org）中進行檢索，物種來源選擇“Homo sapiens”，在設定中將互作分數值設置為最高置信度0.9，隱藏網絡中斷開的節點，獲取靶點互作的網絡關系數據，繪制蛋白-蛋白相互作用網絡（Protein-protein interaction，PPI）。

1.5 GO、KEGG 富集分析將益氣活血方治療DVT的潛在靶點上傳至生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），在線進行基因本體論（gene ontology，GO）。生物學過程富集分析和基于京都基因與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集分析。

1.6 網絡模型的構建及分析將益氣活血方中藥物的活性成分，以及藥物-疾病潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建“藥物-有效成分-靶點-通路”相互作用網絡圖。

1.7 分子對接驗證從PubChem 數據庫、PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）檢索并下載核心化合物和關鍵作用靶點的3D 結構。通過PyMOL 軟件，對核心活性成分和關鍵作用靶點的3D 結構進行去水、加氫，轉換成pdbqt 格式。由autodock vina 1.1.2 軟件完成分子對接分析。最后運用PyMOL軟件將對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 藥物靶點與疾病靶點的篩選結果及處理通過TCMSP、TCMID、Pubchem 數據庫，按照“1.1”項的方法獲得益氣活血方的有效成分，把它們對應的靶點輸入UniProt 數據庫，刪除去重后，最終得到155個潛在活性成分，篩選出246個藥物靶點。以“deep vein thrombosis”為關鍵詞在Gene Cards 數據庫進行檢索，獲得疾病相關靶點1977 個。使用Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺對中藥靶點與疾病靶點取交集，獲得二者交集靶點162個。見圖1。

圖1 益氣活血方-DVT靶點韋恩圖

2.2 構建藥物-疾病潛在作用靶點蛋白-蛋白PPl關鍵靶點提取利用Cytoscape 3.7.2 軟件，導入“2.1”項所得的藥物-疾病潛在作用靶點162個，構建藥物-疾病PPI網絡。見圖2。

圖2 益氣活血方-DVT靶點PPI網絡

從圖中可知，益氣活血方不僅作用于多靶點，還會通過影響靶點之間的潛在作用關系，共同發揮治療作用。

在藥物-PPI 網絡中，共有162 個節點，750 條邊，Degree 平均值為9.26。Degree 為節點的自由度，表示網絡中與該節點直接作用的節點數目，自由度越大則生物學重要性越強。本文提取了自由度前30的潛在作用靶點，以獲得藥物-疾病PPI網絡中的關鍵靶點，可視化結果如見圖3。

圖3 藥物-疾病PPI網絡中的關鍵靶點

研究發現，信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長因子受體等作用靶點在網絡中起到關鍵性作用。

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 為進一步探究益氣活血方中有效成分靶點的基因功能，基于David 數據庫對其進行GO 功能富集分析，共獲得P＜0.05 的條目2577 條，包括：1）生物過程（Biological process，BP）2304 條。主要包括氧化應激反應、對脂多糖的反應、細胞對化學應激的反應、調節DNA 結合轉錄因子的活性、對營養水平的反應、凋亡信號通路調控等方面。2）細胞組分（cellular component，CC）59 條。主要在膜筏、膜微區、膜區、囊腔、胞質囊腔、分泌顆粒腔、小窩、核染色質等靶點富集相對集中。3）分子功能（molecular function，MF）159條。

將所得GO 富集分析進可視化處理，取各項靶點的前30個作成條形圖，結果如圖4—6所示。其中，p.adjust 代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。

圖4 藥物-疾病的GO富集分析圖（BP）

圖5 藥物-疾病的GO富集分析圖（CC）

圖6 藥物-疾病的GO富集分析圖（MF）

2.3.2 KEGG 富集分析 通過David 數據庫，對益氣活血方的靶點在信號通路中的作用進行KEGG通路富集分析。KEGG分析結果表明，162個相關靶點共參與了168 條信號通路過程，包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、糖基化終末產物/糖基化終末產物受體（advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products，AGE/RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路、缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、C 型凝集素受體信號通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性及多種癌癥相關通路等。篩選排名前30 位的信號通路，采用Omic-Share軟件繪制通路信息圖，結果如圖7所示。其中，氣泡圖節點大小和顏色由相關聯基因的數量和P值決定，節點從小到大反映了相關聯基因的數量由少到多，顏色從藍色轉變紅色反映了P值逐漸減小。見圖7。

圖7 前30位的信號通路信息圖

2.4 藥物-有效成分-靶點-通路網絡的構建采用Cytoscape 3.7.2 構建藥物-成分-靶點-通路網絡，結果如圖8 所示，圓形節點代表益氣活血方中的中藥，六邊形節點代表藥物有效成分，V 型節點代表潛在作用靶點，三角形代表信號通路。藥物-成分-靶點-通路網絡共由359 個節點組成，包含2373 條邊。研究發現該方的核心成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、異鼠李素、木犀草素等，可能通過作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6等靶點和PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、白細胞介素17 信號通路等達到治療DVT的作用。

2.5 分子對接從Pubchem和PDB數據庫分別獲取核心化合物的3D結構和關鍵作用靶點的晶體結構。其中，MAPK1 的PDB ID 為：4G6O；VEGFA 的PDB ID為：3QTK。將核心活性化合物和關鍵作用靶點的3D結構加氫去水去配體，再通過autodock vina1.1.2軟件進行分子對接分析。結果表明，益氣活血方的核心活性成分與MAPK1、VEGFA 的分子對接結合能均遠小于-5 kcal/mol；與MAPK1 結合能最低的化合物分別為槲皮素（結合能為-8.0 kcal/mol）、異鼠李素（結合能為-7.9k cal/mol）、山柰酚（結合能為-7.9 kcal/mol）、β-谷甾醇（結合能為-6.8 kcal/mol）。與VEGFA結合能最低的化合物分別為槲皮素（結合能為-8.5 kcal/mol）、異鼠李素（結合能為-8.5 kcal/mol）、山柰酚（結合能為-8.1 kcal/mol）、β-谷甾醇（結合能為-7.6 kcal/mol）。結果表明：槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚與潛在靶點高效結合，結合能低，構象穩定，相應的結果見圖9、表1。

圖9 分子對接示意圖

3 討論

《金匱要略》提出“血不利則為水”，張景岳認為：“凡治腫者，必先治水；治水者，必先治氣?！薄夺t林改錯》中指出“氣虛血必瘀”，故本病基本病機為氣虛血瘀，瘀阻脈絡，根據“氣為血之帥，血為氣之母”的理論，氣能生血、攝血、行血，調暢氣機，故治宜益氣祛瘀、活血通脈。益氣活血方以血府逐瘀湯為基礎加減補氣、破瘀之品，共奏益氣活血通脈之效。

3.1 益氣活血方的有效成分通過“藥物-有效成分-靶點-通路網絡”圖可知槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚、木犀草素等為益氣活血方治療DVT 的重要有效成分。槲皮素不僅能降低血小板的高度聚集、減少血小板顆粒的胞外分泌，還可以抑制凝血酶和人內皮細胞的激活因子X 的活性，減少纖維蛋白凝塊和血液凝塊的形成，起到抗凝和抗血栓作用［10-12］。β-谷甾醇主要有抗氧化、抗炎、降血脂和抗腫瘤等作用［13］，能通過降低毛細血管通透性起到抗炎作用，從而保護血管［14］；β-谷甾醇具有溶栓活性，在體內能夠發揮抗凝活性，有助于預防血栓形成［15］。異鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗血栓、保護血管內皮、抗腫瘤等廣泛的藥理作用［16-17］，異鼠李素作用核因子κB、信號轉導及轉錄激活因子1 而影響誘導一氧化氮合酶的活性，起到抗炎作用，從而保護血管內皮的完整性，還能抑制血小板聚集及血小板激活時必要的活性膠原成分形成，起到抑制血小板凝集及抗血栓的作用［18］。山柰酚具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等功效［19］，能夠抑制凝血酶活性、抑制纖維蛋白聚合物的形成，還能使凝血時間延長，從而減少或防止血栓形成［20］。

3.2 作用關鍵靶點PPI 網絡圖提示益氣活血方治療DVT 的主要靶蛋白有STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6 等。STAT3 可調節膠原誘導的血小板活化和聚集，有可能使血小板在炎癥條件下過度活躍，如IL-6 可增強膠原誘導的STAT3 激活［21］。STAT3 磷酸化可調節TXA2 受體活性，從而調控血小板的活化［22］。MAPK1 和MAPK3 可通過調控炎癥細胞增殖、分化和凋亡，減少血管損傷［23-24］，此外二者也是VEGF 信號通路中的關鍵靶點，可參與血管內皮細胞的分裂和遷徙，促進血管生成［25］。VEGFA 是最主要的血管內皮生長因子，可調控內皮祖細胞［26］，促進受損的血管內膜修復和血管生成［27］。IL-6 是一種促炎和免疫調節因子；DVT 中IL-6 表達增加，MiR-338-5p 可抑制其表達從而減輕炎癥，從而有效減少血栓大小和重量，并達到保護血管內皮細胞的功能［28］；研究表明血栓溶解過程中IL-6 可以誘導巨噬細胞表達CCL2，從而促進巨噬細胞的浸潤，參與血栓溶解［29］。

3.3 信號通路KEGG 富集分析結果表明，益氣活血方治療DVT 主要與PI3K/Akt 通路、MAPK 通路、TNF通路、IL-17通路、HIF-1通路等密切相關。PI3K/Akt 信號通路與細胞生命活動密切相關，主要發揮促進增殖、保護、抗凋亡的作用［30］。PI3K/Akt信號通路可通過上調炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-8 等 的蛋白表達，從而促進DVT 的形成［31］。MiR-9-5p 通過介導PI3K/Akt 自噬途徑促進EPC 增殖、遷移和血管生成，從而促進血栓溶解，加速血栓再通［32］。MAPK 信號通路是調控細胞增殖、轉錄、分化和凋亡的基本信號通路［33］。PDK1可通過調節MAPK 通路中Raf1 的激活來調控血小板血栓素的生成和血栓形成［34］?？功?GPI/β2GPI復合物可誘導血小板活化，并通過p38MAPK 途徑促進血栓形成［35］。丹皮酚通過ERK1/2MAPK 信號通路誘導VEGF165 促進血栓再通［36］。TNF-α 可激活靶細胞刺激組織因子的生成和釋放，抑制纖溶系統相關因子的合成，并誘導細胞黏附因子的合成與釋放［37］。IL-17可介導自身免疫和炎癥反應［38］，它作為免疫應答介質，可損傷血管內皮細胞［39］。IL-17 和TNF-α 相結合時可增加血小板聚集，抑制抗凝作用，導致血栓形成［40］。缺氧條件下，缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達升高，能加快下游相關基因的轉錄和表達，介導血管生成［41-42］。

本研究結果表明，益氣活血方中的槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚等主要活性成分，可能作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGF-A、IL-6 等多個靶點，干預PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、IL-17 等信號通路，從而調控機體炎癥反應及免疫應答、影響血管內血小板聚集及血栓形成、減少細胞缺氧損傷、保護血管內皮，從而發揮治療DVT的作用。