糖絡寧通過外泌體調控IRE1α 誘導細胞凋亡的作用機制研究*

姚偉潔，李 瀟，馮 欣△，許利平

1 首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院，北京 100006；2 首都醫科大學中醫藥學院中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069

中藥復方糖絡寧（以下簡稱TLN）在臨床上治療糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）取得了很好的臨床療效［1-2］，前期實驗發現，TLN 能夠通過抑制雪旺細胞（schwann cells，SCs）中的IRE1α 表達，進而抑制內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）誘導的細胞凋亡，從而改善DPN［3］。外泌體是由不同細胞類型釋放到細胞外空間的納米囊泡，外泌體可以將功能分子轉移至靶細胞，充當細胞間的通訊工具［4-5］。前期研究發現，TLN 能夠通過增加血清外泌體中的miR-322，降低SCs 中IRE1α 的表達，并通過降低IRE1 依賴性衰解（IRE1-dependent decay，RIDD）活性，抑制細胞凋亡［6］。提示外泌體在TLN 抑制IRE1α 誘導的細胞凋亡中發揮了重要的通訊作用。

研究發現，ER stress 發生時，IRE1α 能夠通過募集腫瘤壞死因子受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2），并與凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1）形成IRE1α-TRAF2-ASK1 復合體，進而激活c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化，誘導細胞凋亡［7］。盡管TLN 能夠通過外泌體作為媒介抑制IRE1α 的表達，抑制細胞凋亡，但其能否進一步通過抑制JNK 從而抑制細胞凋亡，至今尚未有研究。因此本實驗以SCs 作為研究對象，通過提取大鼠血清分泌的外泌體干預SCs，進而探討TLN通過外泌體調控IRE1α 抑制細胞凋亡的機制，為糖絡寧治療DPN提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich，批號：S0130）；澳洲胎牛血清（Gibco，批號：10099-141）；TRIzol 試 劑（Invitrogen，批 號：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141-02，全式金）；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AT301-03，全式金）；高效RIPA 組織/細胞裂解液（索萊寶，批號：R0010-100）；蛋白Marker（Genstar，批號：M221）；超敏發光液（Millipore，批號：WBKLS0100）；BCA 測定試劑盒（博奧森，批號：C-0018）；小鼠單克隆p-JNK抗體，兔單克隆Bcl-2 抗體，兔單克隆Bax 抗體（Santa Cruz，批號：sc-6254，sc-7382，sc-7480）；兔單克隆Cytochrome C 抗體，兔多克隆Caspase-3抗體，小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體（Abcam，批號：ab133504，ab13847，ab8226，ab33915）。

1.2 實驗儀器3K15 型低溫離心機（Sigma）；Mini-PROTEAN? Tetra 電 泳 槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot?轉印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培養箱（Thermo）；MLS-3020 型高壓滅菌器（SANYO），CFX96TM實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rid）；AC2-4E1型生物安全柜（ESCO）。

1.3 實驗動物30只SD雄性大鼠，SPF級，6～8周齡，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2016-0006。飼養條件：動物飼養于SPF級飼養室，12 h/12 h晝夜交替、溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%，自由進食飲水。動物實驗經首都醫科大學倫理委員會批準，符合倫理要求。

1.4 實驗細胞雪旺細胞，選購大鼠RSC96 細胞株，購買于American Type Culture Collection（ATCC），培養基為Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）完全培養基，含有4 mM 谷氨酰胺，25 mM 葡萄糖，1 mM 丙酮酸鈉，1500 mg/L 碳酸氫鈉，10% FBS 及1%青鏈霉素混合液。雪旺細胞的培養環境為37 ℃和5% CO2的培養箱。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組與給藥 TLN 原藥材經過2 次煎煮后，將2 次濾液合并，繼續加熱濃縮至膏狀，于真空干燥器中干燥成粉末，臨用前加蒸餾水溶解到10.9 g 生藥/kg。造模方法參照文獻［8］，30 只SD雄性大鼠適應性喂養1 周，分為空白組、模型組和TLN 組，每組10 只。其中模型組和TLN 組腹腔注射60 mg/kg 的鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液，空白組則腹腔注射等量PBS溶液。1周后測定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），FBG≥16.7 mmol/L 表明糖尿病模型建立成功。TLN 組灌胃給予10.9 g 生藥/kg/d 的糖絡寧溶液，持續給藥12 周。空白組和模型組則給予10 mL/（kg·d）劑量的飲用水。最后一次給藥1 h后將大鼠處死，腹主動脈取血，離心半徑13.5 cm，3000 r/min 離心10 min 得到大鼠血清，-20 ℃冰箱保存備用。

1.5.2 外泌體的提取與內化作用 使用差速離心法提取大鼠血清中的外泌體。將大鼠血清依次300 g的離心力離心10 min，2000 g離心15 min，10 000 g離心30 min，收集上清液，繼續70 000 g離心70 min，沉淀即為外泌體。使用PBS 溶解外泌體，用于后續研究。RSC96 細胞制成細胞懸液，并以4×105細胞/孔的數量接種于6 孔板中，于培養箱中放置過夜，待細胞貼壁后，分別將空白組、模型組和TLN 組大鼠血清分離的外泌體與細胞共培養24 h，收集細胞。

1.6 觀察指標

1.6.1 Western blot 法測定蛋白表達 使用RIPA 裂解液提取RSC96 細胞中的蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白濃度。將等量蛋白樣本加入SDS-PAGE 凝膠中，并使用電泳分離蛋白，通過濕轉系統將蛋白轉運至0.45 μm PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜2 h，隨后加入相應一抗，4℃孵育過夜。吸棄一抗并加入相應二抗，室溫孵育1 h 后，加入電化學發光試劑并置于凝膠成像系統中曝光形成圖像。通過Image J軟件計算蛋白樣品的灰度值，計算蛋白的相對表達量，將β-actin 作為內標蛋白，結果以倍數的形式表示。一抗使用情況如下：小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體，小鼠單克隆p-JNK抗體，兔單克隆Bcl-2抗體，兔單克隆Bax抗體，兔單克隆Cytochrome C抗體，兔多克隆Caspase-3抗體。

1.6.2 RT-PCR 法測定基因表達 使用TRIzol試劑提取各組RSC96細胞中的RNA，隨后通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，cDNA繼續通過SYBR預混系統和特異性引物進行RT-PCR 擴增，并通過計算2-△△Ct確定基因mRNA的相對表達水平。以β-actin作為內參，結果以倍數形式表示。引物使用情況見表1。

表1 引物序列

1.7 統計學方法通過SPSS 19.0 進行實驗數據分析。計量資料以±s表示，多組獨立樣本間的比較使用One-Way ANOVA，非正態分布數據使用非參數檢驗方法，P＜0.05 表示組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRAF2、p-JNK 及ASK1 蛋白表達與空白組相比，模型組TRAF2和p-JNK蛋白表達及ASK1 mRNA表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組TRAF2 和p-JNK 蛋白表達及ASK1 mRNA 表達均顯著降低（P＜0.01），表明TLN 能夠通過外泌體抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復合體，進而抑制JNK 的磷酸化，抑制細胞凋亡。見圖1、表2。

圖1 各組TRAF2和p-JNK蛋白表達電泳圖

2.2 Bcl-2和Bax蛋白表達與空白組比較，模型組Bcl-2表達顯著降低，Bax表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組Bcl-2表達顯著升高，Bax表達均顯著降低（P＜0.01），表明TLN 能夠通過外泌體抑制促凋亡蛋白Bax 的表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而抑制細胞凋亡。見圖2、表2。

圖2 各組Bcl-2和Bax蛋白表達電泳圖

表2 各組TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表達比較（±s）

表2 各組TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；與模型組相比，bb表示P＜0.01

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2.3 Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA 表達與空白組比較，模型組Cyto C 和cleaved-Caspase-3 蛋白和Caspase-9 mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白和Caspase-9 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），表明TLN能夠通過外泌體抑制Caspase-3誘導的細胞凋亡。見圖3、表3。

圖3 各組Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表達（±s）

表3 各組大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表達（±s）

注：與空白組相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；與模型組相比，bb表示P＜0.01，b表示P＜0.05

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3 討論

外泌體是大小均一、直徑約為30～100 nm、具有雙層膜結構的球狀或杯狀囊泡，可由細胞分泌或存在于血液、尿液、唾液等體液中，其攜帶多種蛋白質、DNA、mRNA及miRNA等物質，通過與靶細胞結合，使靶細胞發生一系列的生物學效應［4-5］。研究發現，外泌體參與了糖尿病的發生過程，通過分離糖尿病及其并發癥患者血清，并對血清中外泌體的miRNA進行測定，檢測到多種miRNA的表達差異［9］。前期研究發現，TLN能夠增加大鼠血清外泌體中的miR-322，進而降低SCs 中IRE1α 的表達，并通過降低RIDD 活性，抑制細胞凋亡［6］，提示外泌體在TLN 抑制IRE1α 誘導的細胞凋亡中發揮了重要的作用。

JNK是MAPK家族的成員之一，JNK信號通路參與了多種細胞凋亡的發生［10］。ER stress發生時，IRE1α 通過募集TRAF2，并與ASK1 形成IRE1α-TRAF2-ASK1復合體，從而激活JNK的磷酸化，誘導細胞凋亡［7，11］。本實驗的結果顯示，TLN 能夠通過外泌體抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復合體，抑制JNK的磷酸化，進而抑制細胞凋亡。

JNK 還能夠通過上調促凋亡因子Bax，并抑制抗凋亡因子Bcl-2，從而誘導細胞凋亡［12］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的蛋白，二者相互抑制，Bcl-2表達被抑制后，Bax 構象變化并寡聚化，促進線粒體對促凋亡因子敏感性，并破壞ER 膜形態的完整性，Ca2+外流，促進細胞凋亡。本實驗中，TLN 能夠通過外泌體抑制JNK 的磷酸化，從而抑制Bax 表達，并促進Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡。

JNK 同樣可以破壞ER 膜形態的完整性，導致Ca2+外流至線粒體，從而增加線粒體外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），MOMP 則進一步使細胞色素C（Cytochrome C，Cyto C）從內膜釋放至細胞質，上調Caspase-9 和Caspase-3 表達，誘導細胞凋亡。本實驗中，TLN則能夠通過外泌體抑制JNK的磷酸化，從而抑制Cyto C 表達，并進一步抑制Caspase-9和Caspase-3的表達，抑制細胞凋亡［10］。

綜上所述，糖絡寧能夠通過外泌體為媒介，通過抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復合體，進而抑制JNK的磷酸化，然后分別通過進一步抑制促凋亡蛋白Bax 表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，以及抑制Cyto C、Caspase-9 和Caspase-3 的表達，從而抑制ER stress誘導的細胞凋亡。