人臍帶間充質干細胞移植治療角膜堿燒傷的實驗研究

宋東宇,高明宏,李冬梅

0 引言

角膜堿燒傷是比較常見的化學性眼外傷,由于堿具有較強的滲透性,能夠對角膜深層組織造成嚴重的病理性損傷且難以治愈[1]。角膜燒傷的病理損傷進程中會有嚴重的炎癥反應和新生血管生長,大量細胞因子和酶類參與,其中多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)浸潤和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在病理損傷區內新生血管的生長中發揮重要作用[2]。角膜堿燒傷的病理損傷機制復雜,對于重度角膜堿燒傷的診治較為棘手,尚無較為理想的治療方法。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)具有分化增殖快,能力較強、易于制備、易于保存等優點[3],目前在角膜堿燒傷的治療中已有應用,但具體的治療機制及療效亟待深入研究,鑒于此,本研究對兔角膜堿燒傷病灶區進行hUCMSCs移植并觀察角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)生長情況,為臨床治療嚴重角膜堿燒傷提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組選取健康日本白兔75只(首都醫科大學基礎實驗中心提供),12月齡,體質量2.0～2.5kg,雌雄各半,以右眼為實驗眼,分組前采用裂隙燈檢查排除眼部疾病,依據體質量和性別隨機分為A、B、C組,每組25只,相同飲食及環境下飼養。三組實驗兔均建立右眼角膜堿燒傷模型。A組兔右眼在堿燒傷后立即行角膜病灶區羊膜負載hUCMSCs覆蓋術;B組兔右眼在堿燒傷后立即行角膜病灶區羊膜覆蓋術;C組兔右眼在角膜堿燒傷后未進行處理。本研究遵循國家科技部頒布的《實驗動物管理條例》和中國醫學科學院醫學實驗動物研究所編制的《實驗動物安樂死指南》,并獲得首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和儀器主要試劑:鼠抗兔VEGF多克隆抗體、山羊抗鼠IgG(Abcam),SABC試劑盒、過氧化酶、過氧化酶阻斷劑(Bioss公司),硝酸纖維素濾紙(武漢博士德科技公司)。主要儀器:切片機(HM325,日本)、漂烘處理器(PHY-3,廣州)、恒溫箱(ZD600,泉州)、實驗凈化臺(SW-CJ-IFD,北京)、振蕩器(THZ-82型,沈陽)、分析圖像系統(Image8000,澳大利亞)、裂隙燈(SL-2G,Topcon)、生物顯微鏡(CK×53,Olympus)和ImagePlus6.0分析系統。

1.2 方法

1.2.1 兔角膜堿燒傷模型的建立實驗兔右眼表面麻醉(15mL∶75mg鹽酸丙美卡因滴眼液),將浸泡在1mol/L NaOH溶液中的直徑8.0mm的圓形單層濾紙片取出,貼附在角膜中央區,堿燒傷1min后取下,使用500mL生理鹽水沖洗兔角膜表面和結膜囊,2.5g/L氯霉素滴眼液及10g/L阿托品滴眼液點眼,制作Ⅲ級角膜堿燒傷動物模型。裂隙燈下觀察角膜燒傷區透明度、角膜基質燒傷深度,依據中華醫學會眼外傷學組發布的燒傷標準進行評估,符合Ⅲ級角膜堿燒傷程度即為模型制作成功[4]。兔右眼角膜堿燒傷造模后,為避免角膜潰瘍穿孔均給予右眼藥物治療,2.5g/L左氧氟沙星滴眼液(每天3次)、10g/L阿托品滴眼液(每天2次)、紅霉素眼膏(每晚1次)點眼,均連續用藥3d。

1.2.2 羊膜負載hUCMSCs植片的制備本研究應用首都醫科大學基礎實驗中心制備的羊膜負載3代hUCMSCs植片成品進行實驗研究,羊膜基質的hUCMSCs細胞密度為5000cells/cm2(圖1)。

圖1 第3代人臍帶間充質干細胞 臍帶間充質干細胞多為長梭形纖維細胞結構,擬負載至羊膜基質。

1.2.3 手術方法實驗兔進行腹腔注射麻醉(4mL濃度為10g/L的戊巴比妥鈉注射液),將頭部固定于顯微鏡下的手術臺上。A組兔右眼堿燒傷后立即行羊膜負載hUCMSCs植片移植,右眼置開瞼器,20g/L鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉,手術顯微鏡下以負載hUCMSCs的羊膜上皮面朝上平鋪于角膜表面,在角膜緣將羊膜與結膜、表層鞏膜用10-0尼龍縫線間斷縫合4針,剪去邊緣多余羊膜。B組兔右眼堿燒傷后立即進行單純羊膜移植,方法同前。C組兔右眼堿燒傷后不做手術處理。實驗過程中發生嚴重眼內出血或角膜溶解穿孔則予以剔除。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1裂隙燈顯微鏡觀察CNV情況角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d,各組隨機選取5只實驗兔,應用裂隙燈檢查右眼,進行眼前節照相,并對角膜堿燒傷病灶周圍新生血管長入情況進行評分。CNV評分標準:0分:角膜無CNV生長;1分:CNV生長位于角膜緣2mm以內;2分:CNV位于角膜周邊,范圍≤1/2象限;3分:CNV位于角膜周邊,范圍>1/2象限;4分:全角膜均見CNV生長。

1.2.4.2角膜組織切片的制備角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d,各組隨機選取5只實驗兔進行大劑量麻醉處死(經耳緣靜脈注射10g/L的戊巴比妥鈉注射液,150mg/kg),立即用手術剪沿右眼球角膜緣環形剪開球結膜,剪斷眼外肌和視神經,完整摘除眼球,切取帶有少量鞏膜的整個角膜組織,置于10%甲醛溶液中固定48h,之后使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水,二甲苯溶液透明化切片,石蠟包埋后以4μm厚度進行連續切片[1]。

1.2.4.3HE染色觀察PMNs浸潤情況隨機選取每只實驗兔角膜組織切片5張,脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色,200倍光鏡下觀察每張切片,隨機選取病灶區的10個視野進行照相,應用Image 8000分析圖像系統和Image Plus6.0分析圖像儀對圖片進行分析,PMNs為細胞核藍色深染,記錄細胞數,取平均值。

1.2.4.4免疫組化染色觀察VEGF的表達隨機選取每只實驗兔角膜組織切片5張,常規脫蠟,0.3%過氧化氫溶液孵育15min后,修復抗原,血清封閉,滴入稀釋后1∶100濃度的鼠抗兔VEGF多克隆抗體,37℃下孵育1h,加入1∶100濃度的山羊抗鼠IgG和過氧化物酶標SABC溶液,DAB顯色,于400倍顯微鏡下觀察,細胞漿含有棕黃色顆粒的細胞即為VEGF染色陽性細胞[4]。用Image 8000圖像分析系統分析獲得的圖像,在20倍物鏡下輸入圖像采集系統,每張切片隨機選取10個視野,獲取VEGF陽性細胞的光密度值,取平均值。

2 結果

2.1 裂隙燈顯微鏡觀察CNV情況堿燒傷后即可見到角膜中央區有瓷白色邊界清晰的燒傷病灶,病灶直徑約為8mm,深達角膜基質,窺視不清瞳孔及虹膜組織。隨著損傷進展,角膜緣均見明顯充血,堿燒傷后3d時角膜緣可見毛刷樣新生血管芽;7d時可見CNV長入角膜燒傷區,A組和B組兔眼CNV均呈環繞式沿病灶邊緣長入基質層,B組兔眼CNV生長稍快;14d時A組兔眼角膜病灶周圍存在較大范圍的無CNV長入區,B組與A組相比病灶區無CNV生長的面積較小,A組、B組、C組兔眼角膜病灶區CNV評分分別為0(0,0)、1.50(1.25,1.75)、2.50(2.25,2.92)分,三組總體差異具有統計學意義(χ2=40.31,P<0.01),A組與B組比較差異有統計學意義(P<0.01);21d時A組兔眼CNV較前期明顯回退;28d時B組兔眼CNV較前期明顯回退,且A組較B組、C組兔眼CNV生長較少,相對應的角膜病灶區也更加透明(圖2)。

圖2 裂隙燈顯微鏡觀察角膜堿燒傷情況 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后28d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后28d;C:角膜堿燒傷后未處理28d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜表面新生血管最少,角膜堿燒傷后未處理角膜表面新生血管最多,角膜透明度最差。

2.2HE染色觀察PMNs浸潤情況堿燒傷后3d時A組和B組兔眼角膜病灶區損傷明顯較輕,PMNs數量較少,基質層膠原纖維排列清晰平整,羊膜尚未與角膜上皮層融合,較易分離,C組兔眼角膜中央潰瘍,上皮剝脫,病灶區存在PMNs,基質水腫,膠原纖維紊亂;14d時A組和B組羊膜已與角膜上皮基質層大部分黏連融合,膠原纖維排列較整齊,水腫較輕,且增厚均勻一致,A組PMNs浸潤和基質層中CNV生長均較少,C組兔眼角膜上皮層部分修復,細胞腫脹,基質肥厚,膠原纖維斷裂水解,尤其是角膜潰瘍病灶和鄰近病灶的上皮細胞下有大量PMNs浸潤,大量CNV生長,基質層膠原纖維明顯紊亂無序(圖3)。

圖3 HE染色觀察PMNs浸潤情況 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后14d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后14d;C:角膜堿燒傷后未處理14d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜表面新生血管最少,角膜堿燒傷后未處理角膜表面新生血管最多,角膜基質纖維更為紊亂。三角示PMNs;箭頭示新生血管。

角膜堿燒傷后各時間點三組兔角膜PMNs密度隨時間變化波動顯著,堿燒傷后3d時即有大量PMNs產生,7d時有所下降,隨后快速增加并在14d時達到峰值,后逐漸下降,28d時降到接近7d時的量值水平,各時間點組間差異均有統計學意義(P<0.01,表1)。堿燒傷后3、7、14、21、28d時,A組和B組兔角膜PMNs密度均明顯低于C組(P<0.05),且14、21d時,A組兔角膜PMNs密度均明顯低于B組(P<0.05),但3、7d時,A組和B組兔角膜PMNs密度差異無統計學意義(均P>0.05),提示在控制炎癥反應方面羊膜負載hUCMSCs與羊膜覆蓋角膜病灶短期內(<7d)的療效無明顯差異,7d后hUCMSCs成活后促進上皮細胞修復,可明顯減少炎癥反應。堿燒傷后28d時(修復后期),A組和B組兔角膜PMNs密度均低于C組(P<0.05),且A組仍低于B組(P>0.05),提示28d時A組和B組兔角膜上皮均已修復,炎癥得到控制。上述結果表明羊膜負載hUCMSCs移植治療能夠促進角膜上皮較好地修復,療效確切。

表1 兔角膜堿燒傷后各組不同時間點角膜PMNs密度

2.3 免疫組化染色觀察VEGF的表達三組兔角膜堿燒傷后病灶區均有VEGF陽性表達,堿燒傷后3d時,角膜上皮層缺損,角膜緣CNV和PMNs數量增多,PMNs周圍VEGF呈弱陽性表達,在角膜病理損傷進程中,VEGF表達逐漸升高,從角膜邊緣到病灶區中央VEGF表達逐漸升高;7～14d時VEGF分布于角膜上皮和基質層,VEGF表達位于PMNs周圍較明顯(圖4);28d時,VEGF在修復的角膜組織中表達很弱。

圖4 免疫組化染色觀察VEGF的表達 A:角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后14d;B:角膜堿燒傷單純羊膜移植治療后14d;C:角膜堿燒傷后未處理14d。角膜堿燒傷負載hUCMSCs羊膜移植治療后角膜基質VEGF表達最少,角膜堿燒傷后未處理角膜基質VEGF表達最多。細胞漿呈棕黃色為VEGF陽性細胞。

角膜堿燒傷后三組兔角膜中VEGF表達水平均在7～14d時達到峰值,28d明顯降低,各時間點三組組間差異均有統計學意義(P<0.05,表2)。堿燒傷后3、7、14、21、28d時,A組和B組兔角膜VEGF表達水平均明顯低于C組(P<0.05),且7、14、21d時,A組兔角膜VEGF表達水平均明顯低于B組(P<0.05)。上述結果表明羊膜負載hUCMSCs移植治療角膜堿燒傷療效確切。

表2 兔角膜堿燒傷后各組不同時間點角膜中VEGF陽性細胞平均光密度

3 討論

角膜堿燒傷早期潰瘍區就有大量炎癥細胞浸潤,隨病程進展可見持續性損傷、角膜上皮剝脫、基質水腫潰瘍和CNV生成等,在病理損傷修復進程中炎癥反應和CNV起著重要作用[1,5]。McCulley將眼表化學傷的病程分為4個時期,即燒傷期、急性期(0～7d)、修復早期(1～3wk)和修復晚期(>3wk)[4,6]。本研究涉及角膜燒傷期、急性期、修復早期和修復晚期,堿燒傷后角膜病灶區的潰瘍修復和堿性物質的浸潤損傷進程同時存在。

角膜堿燒傷的治療較為棘手,治療方法很多,其中干細胞移植治療角膜堿燒傷的方法包括hUCMSCs結膜下注射、骨髓間充質干細胞移植和人間充質干細胞滴眼液點眼等[7]。Almaliotis等[8]研究向角膜基質內和結膜下同時注射間充質干細胞,結果證實間充質干細胞具有抑制CNV生長和保持角膜透明度的功能。關于羊膜負載hUCMSCs移植治療角膜堿燒傷的療效報道較少。Liu等[9]向大鼠角膜基質內注射hUCMSCs,證實移植的hUCMSCs能在角膜基質中成活和增殖,移植的hUCMSCs成功表達角膜基質蛋白標記物,角膜基質內的膠原纖維可以重排,并可增加基質厚度、改善角膜透明度,提高角膜基質細胞的功能且未誘發免疫應答,同時Call等[10]和Galindo等[11]將注射hUCMSCs應用于角結膜損傷治療的研究也獲得了較好的治療效果。本研究移植羊膜負載的hUCMSCs,較角膜基質注射更簡單易行,且能對角膜堿燒傷中更大面積的病灶區進行hUCMSCs移植,從而促進角膜基質和上皮修復。以往研究證實間充質干細胞能改善角膜透明度,本研究也證實了這一理論。角膜透明度改善的生物機制尚不清楚,分析可能與hUCMSCs調控成纖維細胞活性和抑制基質細胞凋亡等相關[10,12]。Almaliotis等[8]觀察到成功移植間充質干細胞30d后角膜基質透明度明顯改善,而本研究移植hUCMSCs 14d后觀察角膜混濁程度已有明顯改善,基質混濁減輕,能觀察到虹膜和瞳孔,這可能與羊膜負載的hUCMSCs更易成活并快速發揮修復作用有關。

目前關于CNV生長機制的解釋主要有缺氧理論和炎癥理論,研究認為hUCMSCs移植對角膜堿燒傷后炎癥相關性血管化具有抑制作用[13]。本研究中,角膜堿燒傷后病灶區移植hUCMSCs可明顯抑制潰瘍灶周邊CNV的生長,證實移植hUCMSCs具有抑制CNV生長及炎癥反應的雙重作用。羊膜負載hUCMSCs移植可以形成“角膜上皮化”,保護角膜基質,抑制膠原蛋白酶、鐵蛋白酶及溶解酶的損傷作用,減輕角結膜炎癥因子的應激反應,hUCMSCs可促進角膜上皮和基質層的修復,運送生長因子至潰瘍灶,增強眼表抗炎修復作用,抑制PMNs的深層浸潤,減慢潰瘍進展,促進潰瘍修復。角膜堿燒傷病灶區既有PMNs浸潤又有VEGF表達,VEGF能夠促進內皮細胞分泌蛋白酶及蛋白酶原活化因子,誘導血管基底膜的降解,促進細胞侵入周圍基質,并遷移、增生和分化成一個新的含有管腔的血管[14-16]。角膜CNV生成的早期,VEGF在角膜緣的表達明顯增加,逐漸向中央潰瘍灶遷移,在PMNs浸潤部位VEGF表達更明顯,可見VEGF的表達與PMNs的浸潤具有一致性。Jiang等[17]在動物實驗中也證實角膜病灶區VEGF主要來自角膜緣侵入基質層的PMNs。吳聯群等[18]也提出VEGF的表達增強與炎性細胞特別是PMNs的關系密切,VEGF的表達促進了CNV的生成,這與相關實驗中利用結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷抑制PMNs的浸潤,并減少CNV生長的結果一致[6,19]。本研究各觀察時間點A組和B組角膜PMNs浸潤細胞數均低于C組,且角膜堿燒傷后14、21d時A組與B組角膜PMNs浸潤量值存在明顯差異,差異具有統計學意義,充分說明角膜堿燒傷后14d前羊膜移植具有治療作用,14d后羊膜負載hUCMSCs移植成活,在促進角膜基質和上皮修復方面發揮了明顯作用;角膜堿燒傷后7、14、21d時A組與B組VEGF的表達量存在明顯差異,差異具有統計學意義,但28d時A組與B組角膜組織VEGF的表達量差異無統計學意義,提示角膜堿燒傷后7d后羊膜負載hUCMSCs移植即發揮了明顯的修復作用,在實驗晚期(28d時)A組與B組均已完成角膜病灶區的上皮化,VEGF的表達無明顯差異。本研究結果為臨床治療角膜堿燒傷的hUCMSCs移植提供了理論依據,為臨床選擇抗炎及抑制血管生成的最佳治療時機提供參考。

根據本研究中PMNs和VEGF的變化趨勢,角膜堿燒傷后3d眼表即需要頻點抗生素滴眼液,可以稀釋殘留的化學物質,有效減輕炎癥反應,而7～21d是角膜潰瘍溶解期,在抗炎同時要抑制VEGF的活性,減少新生血管的生成,確保角膜透明度。堿燒傷14d后,眼表可以應用促進上皮和基質修復的眼膏和眼液,促進修復的同時抑制角膜血管翳[4,6,19-21]。在臨床診治上,炎癥反應和VEGF促進CNV生成關系密切,角膜堿燒傷的病理損傷和修復過程復雜,炎癥反應與VEGF的相關性,羊膜負載hUCMSCs移植抑制CNV生長和減輕角膜混濁的機制,尚需實驗深入研究。