IDH突變調控BMP2、COL27A1和SERPINA5基因表達影響人腦膠質瘤的生存預后

包逸雯 朱偉良

膠質瘤是顱內最常見的原發性惡性腫瘤[1]，預后較差，占所有膠質瘤一半以上的膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）的5、10 年生存率僅在5%、0.71%左右[2，3]。低級別膠質瘤（low-grade gliomas，LGGs）的預后常優于GBM，有些LGGs 亞型的5年生存率在41%～88%[4]。研究表明，異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變型膠質瘤病人生存預后相對IDH 野生型膠質瘤病人要好[5]。因此，分析IDH 突變導致的基因表達差異具有重要的臨床意義。近年來，成纖維細胞在膠質瘤中的多能性備受關注，包括與其他類型細胞的交聯、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的構建以及免疫調節等作用[6～8]。本文擬采用生物信息學方法探討膠質瘤IDH突變是否通過調控成纖維細胞基因表達抑制膠質瘤惡性生物學行為，從而改善病人預后。

1 資料與方法

1.1 數據收集計算機檢索TCGA 數據庫（https://por?tal.gdc.cancer.），通過UCSC Xena 下載GDC-TCGAGBM 和GDC-TCGA-LGG 相關RNA-seq。648 例膠質瘤（234 例GBM和414例LGG）的RNA-seq數據來自CGGA數據庫[9]。此外，從GEO數據庫下載單細胞RNA-seq 數據集GSE131928（包含28 例IDH 野生型GBM）[10]。

1.2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的識別CGGA 數據庫膠質瘤RNA-seq 數據分 析DEGs 時，P<0.05 和FC>1.5 的 基 因 被 認 為DEGs。TCGA 數據庫膠質瘤RNA-seq 數據分析DEGs時，P<0.05和FC>2被認為DEGs。

1.3 基因富集分析通過R 統計軟件包clusterProfil?er、KEGG.db、clusterProfiler進行GO富集分析、KEGG分析和GESA 相關分析。Entrez 基因id 是從“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”文件中檢索到的。

1.4 生存分析首先利用GEPIA（http://gepia.cancerpku.cn/）中的“Expression on Box Plots”模塊對腫瘤組織和正常組織的靶基因進行單因素生存分析，Cox比例風險分析和預后模型通過R 統計軟件包survmin?er、survival、rms、pROC和RColorBrewer進行分析。

1.5 腫瘤純度、免疫細胞浸潤和免疫微環境的評估通過R軟件包ESTIMATE、MCPcounter評估膠質瘤樣本的腫瘤純度和腫瘤微環境中基質細胞等比例。

1.6 單細胞聚類分析單細胞RNA-seq 數據集（GSE131928）的細胞聚類由R 軟件包Seurat 進行分析。首先，采用“LogNormalize”縮放歸一化方法，去除具有超過2 500或<200、>5%線粒體計數的獨特特征細胞。在數據歸一化后，使用帶有默認參數的UMAP執行單元格的非線性降維。最后，通過t-SNE方法和UMAP 方法劃分生物標志物簇。此外，通過DEGs的富集分析，再次鑒定出免疫細胞亞群和成纖維細胞亞群。

1.7 數據可視化生信分析結果通過多種R 軟件包可視化，包括GOplot、enrichplot、ggplot2、Complex?Heatmap、forestplot和ggforestplot等，以及應用Graph?Pad Prism 9和Adobe Photoshop 2020等專業軟件。

2 結果

2.1 IDH突變顯著下調LGGs細胞活性以及與細胞外因子的結合能力GO富集分析顯示IDH突變顯著下調的DEGs主要參與細胞活力的調節，包括細胞因子受體復合物、免疫復合物等。此外，IDH突變顯著抑制LGGs腫瘤細胞與細胞外因子的結合能力，包括細胞因子、趨化因子、ECM成分等。KEGG分析結果再次驗證IDH 突變下調ECM 構建相關的通路。信號通路圖譜提示這些DEGs 幾乎覆蓋了ECM 構建通路。IDH突變上調的DEGs也被富集，但并未顯著參與ECM 的構建。這提示IDH 突變會削弱腫瘤細胞活力和抑制胞外結構構建，降低腫瘤細胞的侵襲性。

2.2 篩選同時影響LGGs和GBM 生存預后的DEGs GEPIA 數據庫的“Survival Plots”模塊對IDH 突變產生的DEGs 進行單基因生存分析，成功篩選出超過50 個顯著改變LGGs 病人總體生存期的DEGs，12個顯著影響LGGs 和GBM 生存預后的靶基因，包括BMP2、COL27A1、SERPINA5 和VEGFA 等（圖1A）。多變量coxph 分析發現，TCGA-LGG、CGGA-LGG、TCGA-GBM 和CGGA-GBM 中BMP2、SERPINA5 和COL27A1 表達水平與病人生存預后相關（圖1B、1C）。Cox 回歸分析顯示BMP2 和SERPINA5 的組合比單獨BMP2 或SERPINA5 具有更高的預測價值。這提示BMP2、COL27A1和SERPINA5可能是影響膠質瘤病人生存預后的關鍵基因。

圖1 BMP2、COL27A1和SERPINA5的表達水平顯著影響膠質瘤病人的生存預后

2.3 膠質瘤IDH突變與BMP2、SERPINA5、COL27A1基因表達水平的相關性CGGA 數據庫樣本分析結果顯示，IDH突變顯著下調BMP2在LGGs和GBM中的表達，而顯著上調COL27A1 和SERPINA5 的表達（圖2A、2B）。這提示IDH突變是改變三個靶基因表達水平的共性條件。相關性分析顯示，無論是GBM還是LGGs，BMP2 與COL27A1 和SERPINA5 呈中等強度負相關（圖2C、2D），而SERPINA5 與COL27A1呈中等強度正相關（圖2C、2D）。

圖2 膠質瘤IDH突變與BMP2、SERPINA5、COL27A1基因表達水平的相關性分析

2.4 基質評分和成纖維細胞豐度與膠質瘤預后不良呈正相關免疫估算結果顯示COL27A1 和SERPI?NA5高表達、BMP2低表達的數據集基質評分明顯增高，IDH 突變顯著下調四個數據集的基質評分。MCPcounter 評估結果顯示IDH 突變和BMP2 高表達顯著降低LGGs成纖維細胞的絕對豐度，而COL27A1和SERPINA5高表達顯著增加成纖維細胞的絕對豐度（圖3）。GBM 成纖維細胞的絕對豐度顯著高于LGGs。這提示IDH突變也許通過上調BMP2以及下調COL27A1 和SERPINA5 表達，抑制膠質瘤ECM 的構建和成纖維細胞豐度，最終影響病人的預后。

圖3 膠質瘤IDH 基因型以及BMP2、COL27A1、SERPI?NA5表達水平與成纖維細胞豐度的關系

2.5 IDH野生型GBM 中成纖維細胞的多能性 包含28 例IDH 野生型GBM 的單細胞數據集（GSE131928）被聚類分析[13]，最后篩選出成纖維細胞亞集。GSM3828672 第8 亞組的富集分析顯示成纖維細胞增強內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞的趨化性，并促進微血管的形成；成纖維細胞也可以正向調節上皮細胞向間充質細胞轉化并促進間充質細胞增殖和分化。KEGG 分析顯示PI3K/Akt、MAPK 和Ras 等信號通路在成纖維細胞中被激活。GSM3828673第11亞組富集分析顯示成纖維細胞激活包括脂肪酸代謝、丙酮酸代謝、類固醇代謝等多個能量代謝通路。因此，我們推測成纖維細胞不僅促進ECM的框架構建，還賦予血管內皮細胞和膠質瘤細胞合適的生存環境。這些過程可能是成纖維細胞導致惡性程度最高的IDH 野生型GBM 治療預后差的因素之一。

3 討論

即使采用手術聯合術后放化療等綜合治療，幾乎所有GBM 仍會復發，中位生存期僅12～15 個月[11]。而IDH野生型LGGs 通常比IDH突變型更早、更快地復發[12]。盡管IDH突變作為保護性因素在膠質瘤治療中已形成廣泛共識，但IDH 的保護性機制仍未完全被認知。為了探討其潛在機制，我們從CGGA 數據庫和TCGA 數據庫獲取包括LGGs 和GBM 在內的四個數據集，采用多維度多樣本的分析，以IDH 突變為切入點，結果顯示BMP2、SERPINA5和COL27A1三個基因的表達水平的變化會影響LGGs 和GBM 的生存預后，并與IDH 突變高度相關。這與既往報道較為一致[13～15]。

那么，IDH 突變是如何調控BMP2、COL27A1 和SERPINA5 的表達水平來影響膠質瘤的侵襲性？基于CGGA 數據庫相關差異分析的結果表明，IDH 突變下調BMP2的表達，并上調COL27A1和SERPINA5的表達。這提示IDH突變是改變三個靶基因表達水平的共性條件。那么，明確BMP2、COL27A1 和SERPINA5之間是否存在從屬關系尤為重要。為此，我們進行相關性分析，結果顯示無論GBM 還是LGGs，BMP2 與COL27A1 和SERPINA5 呈中等程度負相關，而COL27A1 和SERPINA5 呈中等強度正相關。此外，熱圖聚類分析結果與相關性分析結果一致，即三種基因之間找不到絕對從屬關系。因此，這三種基因對膠質瘤的影響可能以多元化途徑調控腫瘤微環境的變化，例如對免疫微環境的調控，而非直接通過胞內信號通路作用徹底改變腫瘤細胞活力。

BMP2、SERPINA5 和COL27A1 三者之間沒有絕對的從屬關系，可能更多受IDH突變的影響，并可能以多信號通路的形式調控腫瘤細胞侵襲性。基于IDH突變的富集分析顯示細胞外基質構建是IDH突變影響最為廣泛的信號通路，而基質構建是影響膠質瘤治療預后的關鍵因素之一。我們嘗試通過PPI網絡來挖掘BMP2、SERPINA5、COL27A1 之間的相關作用以及對上下游關鍵蛋白節點的調控機制，但是未能有效挖掘。因為PPI 蛋白互動分析是依賴于前人的研究結果，但目前SERPINA5、COL27A1 對腫瘤細胞的影響機制的相關研究仍較少。

總之，我們的結果提示在基因表達水平層面，IDH突變誘導BMP2上調、SERPINA5和COL27A1下調，通過調控腫瘤免疫微環境和成纖維細胞功能活性，降低膠質瘤細胞惡性度。當然，我們基于生物信息學分析得出的相關結論仍需要更多相關領域的研究結果加以論證。