串聯質譜技術在新生兒遺傳代謝病篩查中的應用研究進展

趙娜

[ 關鍵詞] 串聯質譜；新生兒；篩查；遺傳代謝病；氨基酸；酰基肉堿

[ 中圖分類號] R722.1 [ 文獻標識碼] A [ 文章編號] 2095-0616（2023）08-0051-04

遺傳代謝病（inherited metabolic disorders，IMD）以常染色體遺傳為主，由于基因突變，使得其編碼的受體、酶、膜蛋白或運載蛋白的結構或功能發生變化[1-2]，從而使生物合成造成缺陷，導致糖、脂肪、蛋白和微量元素代謝障礙，使得必要代謝產物合成不足或毒副產物過度堆積，是一種多臟器疾病[3-5]。IMD 臨床表現缺乏特異性，多見代謝紊亂、心功能異常、嘔吐、神經異常、肝功能異常、腎功能異常，一些患兒伴皮膚和毛發顏色異常、容貌異常、眼部異常、特殊尿味、昏迷、肌張力低、酸中毒或高血氨等。該病可造成患兒嚴重的生長發育障礙和智力低下，影響神經和消化系統，具有致死性，給患者及其家庭帶來了極大的經濟和精神負擔。在中樞系統發育之前或出現嚴重癥狀之前，如果不能給予有效治療，該病難以達到理想的治療效果[6-7]。IMD 包括氨基酸代謝異常、有機酸代謝障礙、脂肪酸代謝紊亂等，同樣的IMD 病種的表型會有較大差異，不同病種也會有相似的臨床表現，因此診斷有難度。隨著基因診斷技術的普及，臨床醫生對IMD 的識別能力迅速提高，迄今已發現1000 余種IMD，雖然單一病種的發病率不高，但總體發病率較高[8-9]。據統計，IMD 總體患病率已高達1/3000 ～ 1/6000[10]，是出生缺陷的重要原因。其中很多病種可以通過飲食控制和調整、藥物、移植等手段達到接近正常人的生存質量，因此早期篩查和診斷尤為重要。

1 IMD概況

IMD 按照分子量劃分，可以分為大分子病和小分子病，其中大分子病包括線粒體病，溶酶體貯積癥等，小分子病包括氨基酸代謝障礙、有機酸代謝障礙、脂肪酸代謝異常。其中，小分子病的篩查和診斷可以通過檢測血液中氨基酸、肉堿等指標的濃度來實現。目前已發現的IMD 種類逐漸增多，單一病種發病率不高，IMD 的發病率在全國各地區也各不相同，疾病種類也不相同，據報道[11]，氨基酸代謝異常疾病發病率為1/13 800、脂肪酸代謝異常疾病發病率為1/10 400、有機酸代謝異常發病率為1/14 700。

氨基酸代謝異常，也稱氨基酸血/ 尿癥，是因為氨基酸代謝異常而造成的一組疾病，蛋白質代謝路徑中需要關鍵酶的作用，當基因突變導致這些酶的功能發生損傷時，造成氨基酸合成和分解代謝障礙，均為常染色體隱性遺傳[12]。氨基酸代謝病通常對子宮內胎兒的生長發育不產生影響，早期只表現出輕度的精神和運動方面的發育遲緩，一般無體征，直到幾年后才有明顯癥狀。典型疾病包括苯丙酮尿癥、高鳥氨酸血癥、高甲硫氨酸血癥、楓糖尿病、同型半胱氨酸血癥、瓜氨酸血癥、四氫生物蝶呤缺乏癥、精氨酸酶缺乏癥等，疾病篩查實驗通過對血中氨基酸例如苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）、瓜氨酸（citrulline，CIT）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、鳥氨酸（ornithine，ORN）、甲硫氨酸（methionine，MET）、亮氨酸（leucine，LEU）、精氨酸（arginine，ARG）濃度測定以及比值實現疾病篩查。其中，苯丙酮尿癥的患病率是我國新生兒篩查疾病中患病率最高的，達1/11 144[13]。該病早期無明顯體征，但隨著患兒年齡的增長，臨床癥狀逐漸明顯，患兒智商低下，且是不可逆的，可見新生兒IMD 篩查是出生缺陷預防的重要防線[14]。

有機酸代謝異常，也稱有機酸血/ 尿癥，是由于氨基酸代謝、脂肪酸氧化、糖代謝途徑中需要的某些酶的異常缺陷，導致在分解代謝過程中產生的代謝產物有機酸在體內增加、蓄積，從而造成神經系統及其他多器官的損害，嚴重時會表現出代謝性酸中毒、低血糖、高血氨等癥狀。甲基丙二酸血癥是有機酸代謝病中最常見的，其次是丙酸血癥、異戊酸血癥、戊二酸血癥Ⅰ型、3- 甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏癥、生物素酶缺乏癥等，疾病篩查實驗可通過對標本中氨基酸和肉堿例如MET、丙酰肉堿（propionylcarnitine，C3）、C3與乙酰肉堿（acetylcarnitine，C2）比值、異戊酰肉堿（isovalerylcarnitine，C5）、3- 羥基異戊酰肉堿（3-hydroxyisoamylcarnitine，C5-OH）等指標篩查疾病[15]。因此及時進行新生兒IMD 篩查對保證患兒生存質量至關重要。

脂肪酸代謝異常，是由于多種酶的缺陷導致脂類在體內合成分解、消化吸收和轉運出現異常的一組代謝缺陷性疾病。臨床會表現出人體能量代謝降低，疲乏無力、驚厥、頭暈眼花、心律失常、低血糖、發作性饑餓性意識障礙、糖尿病、腦病、肝功能損害、肌病和心肌病，高脂血癥等癥狀，嚴重者會危及生命，多見于嬰幼兒，過去常把這種臨床表現誤診為嬰兒猝死綜合征、Reye 綜合征[16-17]。脂肪酸代謝過程中，肉堿和脂肪酸結合形成酰基肉堿，并通過線粒體膜進行氧化供能，因此在應用串聯質譜進行篩查時，用酰基肉堿濃度作為脂肪代謝的檢測指標。常見的脂肪酸代謝異常有原發性肉堿缺乏癥、肉堿棕櫚酰轉移酶缺乏癥、短鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥、中鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥、極長鏈酰基輔酶A 缺乏癥等，疾病篩查實驗通過對標本中酰基肉堿例如游離肉堿C0，短鏈酰基肉堿C2、C3、C4、C5，中鏈酰基肉堿C6、C8、C10，長鏈酰基肉堿C12、C14，極長鏈酰基肉堿C16、C18 等指標濃度進行臨床判斷。因此臨床中有必要對新生兒IMD 進行積極的篩查工作，為疾病發現和及時診治提供科學依據。

2 IMD篩查國內外研究現狀

對IMD 早發現、早診斷、早治療十分重要。但常規篩查方式，由于疾病、藥物或飲食等因素對體內生化代謝物濃度造成影響，因此篩查結果具有很大程度的不確定性。高效液相串聯質譜技術能夠對血液中多種氨基酸和肉堿進行定性和定量分析，通過氨基酸、肉堿及相應指標的比值，快速篩查和診斷氨基酸、有機酸、脂肪酸代謝異常疾病。這是一種高效率、高特異性、高敏感度的快速檢測技術。1961年，美國Guthrie 醫生測定濾紙干血片中苯丙氨酸濃度采用細菌抑制法，這種簡便且方便運送的檢測方法可以應用于開展大規模人群篩查[18]。至今，人們通過新生兒疾病篩查的手段來發現并預防IMD 的危害已有近60 年歷史。新生兒疾病篩查技術從細菌抑制法發展到酶聯免疫法、時間分辨法、熒光法，但這些檢測方法篩查效率不高，一般是一次實驗過程只能檢測一種疾病。20 世紀80 年代，電噴霧和質譜技術能夠對多種氨基酸、酰基肉堿和有機酸進行快速、高效地檢測。Millington 等[19] 很快將一次實驗檢測多種疾病的質譜技術應用于新生兒疾病篩查，將疾病篩查種類擴展到多種，使新生兒疾病篩查得到了飛快發展。早在1990 年，串聯質譜技術率先在美國被應用于新生兒代謝病的篩查，目前歐美、日本、韓國、新加坡以及我國臺灣等國家和地區，也將串聯質譜技術普遍用于新生兒IMD篩查[20-21]。我國于1981 年開始對先天性甲狀腺功能減退及苯丙酮尿癥的新生兒進行疾病篩查。串聯質譜篩查在我國大陸地區開展相對較晚，21 世紀初，我國上海和浙江地區率先將串聯質譜技術應用于新生兒IMD 檢測，在多種IMD 的篩查、診斷、治療等方面積累了寶貴的經驗[22]。經過多年的探索和發展，中國的新生兒疾病篩查從自發開展發展到系統、有序地規劃組織。隨著串聯質譜技術的發展，人們對IMD 的認識程度越來越高，疾病被發現的種類也逐漸增多。隨著IMD 篩查方法敏感度的提高和治療技術手段的發展，IMD 篩查的病種由苯丙酮尿癥一種增加到幾十種，近些年在一些發達地區，串聯質譜技術也用來篩查X- 連鎖腎上腺腦白質營養不良癥、溶酶體貯積癥等。串聯質譜技術的飛速發展為一次實驗檢測多種疾病的模式提供了高特異性、高敏感度、高選擇性的手段。對降低患兒的出生缺陷和病死率、提高出生人口素質，有著重要意義。我國串聯質譜技術發展速度飛快，目前在很多地區開展了新生兒疾病篩查串聯質譜技術。2018 年，中國新生兒篩查專家組在全國進行了應用高效液相串聯質譜法進行新生兒IMD 篩查的調查，統計結果顯示總患病率在1/3153[10]，中國仍然面臨形勢嚴峻的出生缺陷預防工作。高效液相串聯質譜技術必定將成為新生兒疾病篩查的重要手段，對中國提高出生人口素質，出生缺陷防治工作有著重要意義。

3 IMD篩查結果的影響因素

新生兒疾病篩查串聯質譜項目是指利用串聯質譜技術對新生兒濾紙干血斑中的氨基酸、肉堿及相應比值進行定量檢測，然后臨床醫生根據檢測物的濃度水平判斷患IMD 的風險程度。串聯質譜疾病篩查報告單中包含79 個項目（代謝物指標和代謝物之間的比值），代謝物濃度和比值均有對應的參考范圍，對于高于或低于參考范圍的濃度指標，都被系統判讀為可疑陽性，在報告單中分別用↑和↓標記。陽性率是指可疑陽性的樣本數占總樣本數的百分比。通過總結發現，陽性率在不同地區間存在較大差異，同一地區不同指標陽性率也存在較大差異，同一地區同一指標在不同時間也可能存在差異。本文體現了新生兒IMD 篩查指標切值建立方法專家共識的執行標準。應用串聯質譜篩查IMD，其結果主要有以下影響因素。

3.1 未建立自身實驗室的參考范圍

每個地區的篩查實驗室在篩查一定數量的標本后，應對本實驗室檢測的數據進行統計，建立自己的新篩參考范圍，并定期進行校正[23]。串聯質譜新生兒疾病篩查項目的初篩陽性率一般較高，主要原因是對某些指標的參考范圍設置不合適，建立本實驗室參考范圍后，初篩陽性率和指標陽性率可大幅改善。

3.2 血片質量

C2、MET、ARG 這三個指標一般在溫度和濕度都高的月份，陽性率會高，主要表現為低于參考值范圍。如果C2 偏低會導致比值項目C3/C2 升高，如果C3/C2 升高，又會增加甲基丙二酸血癥的初篩陽性率。通過對送檢單位的血片質量督查，注意血片要在室內自然晾干，避免在高溫、高濕環境下晾干，避免陽光、爐子、暖氣等物體烘干，不得接觸有機溶劑，做到無污染、無霉變，且晾干后要置于密封袋并存儲于冰箱，2℃～ 8℃冰箱保存，運輸過程密封低溫運輸，采集后5 個工作日內遞送，可降低這幾類指標的初篩陽性率。

3.3 實驗污染或儀器污染實驗污染

和儀器污染導致的指標陽性率高可以通過監測空白孔的濃度或某些指標的陽性率發現問題。比如C5DC+C6OH、C6、C8 等指標，當這類指標空白孔濃度水平和樣本濃度水平升高時，可能和移液吸頭質量、移液槽質量等有關，更換質量有保障的移液吸頭和移液槽后該問題即可解決。儀器污染來源包括流動相污染、管路污染、進樣口污染、離子源污染、三重四級桿內部污染等。其中儀器長時間未清洗維護是最常見的一種情況，可能會導致指標空白孔濃度和樣本濃度水平升高，該異常情況可通過清洗三重四級桿解決。

3.4 質控異常波動

由于實驗室環境變化、前處理內標工作液配制、儀器開關機后未校準等原因導致室內質控波動幅度較大時，樣本的濃度水平也會隨之波動，從而導致某些指標陽性率的異常波動。在室內質控異常波動時，可以通過校正RRF 值來使樣本的濃度水平保持在正常水平。

3.5 攝入藥物影響

新生兒代謝水平在剛出生后可能會不穩定，也會受某些藥物影響。來自新生兒科等臨床科室的血片，某指標陽性率會受一些藥物影響，例如氨基酸水平升高可能和靜滴氨基酸有關；口服左卡尼丁可導致酰基肉堿及游離肉堿C0 水平升高；頭孢類藥物可能會導致C5 增高[24-25]。新生兒科樣本采集時，建議將母親及新生兒的用藥情況特殊標注。

4 小結

綜上所述，近年來隨著高效液相串聯質譜技術的不斷發展，越來越多的地區開展多種新生兒IMD的篩查工作，更多的IMD 種類被發現。目前我國在應用串聯質譜技術篩查新生兒IMD 工作中，參考值范圍差異較大，實驗室需要對數據進行統計，建立自己的新篩參考范圍，并定期進行校正。完善新生兒IMD 篩查工作，對IMD 進行早發現、早治療，對于提高出生人口素質具有重要意義。