芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的網絡藥理學機制研究

謝 婷，劉靜霞，呂瑞民

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040

葡萄膜炎（Uveitis）是發生于葡萄膜等多個部位的炎癥致盲性眼病，青壯年容易罹患，常反復發病，可引起青光眼、白內障等嚴重的并發癥，導致了全球5%～10%的視力障礙，發病率具有地域、人群、類型、病因等因素之間的差異性。可由于感染因素（細菌、真菌、寄生蟲、病原體等）發病，還可由于非感染因素導致，例如自身免疫的因素（CD4+T細胞及相關的細胞因子等）、創傷和理化損傷以及免疫遺傳的因素［1-2］。臨床比較普遍的治療手段多為在局部或者全身使用糖皮質激素，免疫抑制劑和生物制劑等，雖效果確切，但亦有許多嚴重副作用，且中止用藥后很容易再發，降低了病人的生活品質［3-4］。葡萄膜炎屬于瞳神疾病，病因有外邪攻于目，或臟腑病變連及目，病位涉及黃仁、視衣、神水、神膏等，主要與肝、脾、腎功能失調相關［5］。中醫藥具有治療效果好、副作用小、多成分、多靶點、多渠道的優點，在治療葡萄膜炎方面，中藥可以達到降低炎癥的水平、恢復功能的治療效果［6-7］。芍藥甘草湯是經過古今中醫臨床廣泛使用且療效上佳的方子，出自張仲景的《傷寒論》，由“白芍”和“甘草”兩味中藥構成，合用有酸甘化陰、調和肝脾、柔筋止痛之功，現代研究證明有抗炎和免疫調節等多種藥理作用［8］。芍藥甘草湯治療葡萄膜炎臨床效果顯著，能改善實驗性免疫性大鼠的臨床體征［9-10］。網絡藥理學是從整體上探究藥物在分子層面上對疾病發生治療作用機制的一種方法，與祖國醫學整體觀念與辨證論治的原則相吻合，運用網絡藥理學的方法研究中醫藥治病的作用機理是一種新興趨勢［11］。本文基于網絡藥理學研究探析芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的作用機制。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和作用靶點的獲取

以“白芍”和“甘草”為關鍵詞，在TCMSP查找，得到兩味藥活性成分，以“口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18”為條件進行篩選。得到的成分在TCMSP上收集靶點。在UniProt 蛋白質數據庫上選定“人”的物種，將收集得到的靶點基因用UniProt名稱表示。

1.2 “中藥—成分—靶點”網絡構建

將信息上傳到Cytoscape 3.8.0 版本的軟件對“中藥—成分—靶點”之間的關系進行分析和構建網絡。

1.3 疾病靶點和交集靶點的獲取

以“uveitis”為搜索詞，在GeneCards、OMIM、Dis-GeNET、DrugBank等數據庫檢索，獲得疾病靶點。在Uni-Prot上選定“Reviewed”，并以“Human”為物種，將收集得到的靶點基因用UniProt名稱表示。通過Venny將兩味中藥活性成分和疾病兩者所有的UniProt 靶點基因名稱取交集并繪制韋恩圖，獲得交集靶點基因。

1.4 蛋白—蛋白相互作用（PPI）網絡構建

將交集靶點基因信息在STRING 中輸入，物種上選擇“Homo sapiens”，獲得PPI數據文件，再將文件上傳至Cytoscape進行分析數據以及構建PPI網絡。

1.5 GO（Gene Ontology）基因功能和REGG富集分析

將交集靶點信息在DAVID 平臺上傳，進行富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，將結果中排名靠前的用微生信在線工具作圖。

2 結果

2.1 中藥活性成分及作用靶點

在TCMSP 中獲得白芍13 種成分，甘草92 種成分，共有成分有3 個，未找到相關靶點的成分白芍有5 個，甘草有4個，其余成分靶點去除重復靶點后有214個靶點。

2.2 “中藥—成分—靶點”網絡

將相關數據列入EXCEL 表后導入Cytoscape 構建網絡圖。該圖由309 個節點（2 味中藥、93 個成分和214 個靶點）和1 541 條邊組成。成分中節點度前5 的是：槲皮素（GC85，quercetin，MOL000098）作用于139個靶點，山柰酚（A3，kaempferol，MOL000422)作用于113 個靶點，β-谷甾醇（BS4，beta-sitosterol，MOL000358）作用于36個靶點，7-甲氧基-2-甲基異黃酮（GC8，7-Methoxy-2-methyl isoflavone，MOL003896）作 用 于35 個 靶 點，柚 皮 素（GC11，naringenin，MOL004328）作用于32個靶點。

2.3 疾病靶點、交集靶點及PPI網絡

在GeneCards、OMIM、DisGeNET、DrugBank 數據庫檢索中依次獲得1 346、11、247、204 個靶點，去除重復項得到1 463 個靶點。成分與疾病靶點取交集得到93 個。將交集靶點導入STRING 后獲得文件，再將文件上傳至Cytoscape 得到PPI 網絡圖。此圖包括93 個節點和1 680 條邊，節點的面積變化依據degree 值而定，邊線條的寬度變化由Combined Score 值決定，PPI 度值排名前20，見表1。

表1 芍藥甘草湯與葡萄膜炎交集靶點PPI度值排名

2.4 GO和KEGG富集分析

將93 個交集靶點導入DAVID 平臺，進行GO 和KEGG富集分析，P＜0.05 作為篩選條件，得到GO 項目結果顯示：生物工程509 條，主要包括細胞因子介導的信號通路、藥物反應、炎癥反應、基因表達的正調控等；細胞組分40條，包括細胞外間隙、轉錄因子復合物、細胞外區、核質、高分子絡合物、染色質等；分子功能85條，包括酶結合、轉錄因子活性，序列特異性DNA結合、蛋白質同源二聚化活性、轉錄因子結合、相同蛋白結合、細胞因子活性，蛋白質結合等。KEGG 通路145 條，主要涉及脂質與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、癌癥的途徑、腫瘤壞死因子信號通路、弓形蟲病、Th17細胞分化等。選取GO 中P 值排名前10 以及KEGG 中P 值排名前20信息作圖，見圖1和圖2。

圖1 芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的關鍵靶點的GO富集分析

圖2 芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的關鍵靶點的KEGG富集分析

3 討論

葡萄膜炎的發病機制十分復雜，大多與細胞因子介導的免疫炎癥反應相關。本研究共挖掘出芍藥甘草湯活性成分93 個，成分潛在靶點214 個，葡萄膜炎疾病相關靶點1 463 個，“成分—疾病”交集靶點93 個。在芍藥甘草湯“中藥—成分—靶點”網絡中，degree值較高的成分有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花素等。已有研究表明，槲皮素不僅能夠進行免疫調節，還可以達到抗炎、抗氧化等療效。槲皮素削弱了鏈球菌感染導致的細胞毒性，并抑制細菌刺激導致的IL-1β、IL-6 和TNF-α的釋放，還推動了IL-10 的分泌［12-13］。山奈酚既具有抗炎的作用，還能夠發揮抗氧化、抗癌的效果，通過增加活化巨噬細胞的數量來降低脂多糖(LPS) 導致發生TNF-α和IL-1的表達［14］。β-谷甾醇能通過抑制TNF-α、IL-17、IL-6 和IL-1β等炎癥細胞因子引發的炎癥反應而達到抑制顱內動脈瘤的生長的效果［15］。柚皮素也具有抗炎的作用，可以通過抑制NF-κb 通路、調節MMP-2 和MMP-9 等機制來減少促炎性細胞因子的分泌，比如炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β［16］。芒柄花素可以加快免疫活性細胞的生長，來達到在免疫抑制狀態下的小鼠免疫功能得到加強的目的［17］。芒柄花素可以改善小鼠腦缺血再灌注損傷，降低炎性因子（IL-1β、TNF-α）的表達，從而可以抑制炎癥反應［18］。

芍藥甘草湯與葡萄膜炎“交集靶點”PPI 網絡中degree 值較高的靶點有絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、TNF、IL6、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、PTGS2等。AKT 家族有3 種亞型包括：AKT1（PKBα）、AKT2（PKBβ）和AKT3（PKBγ），其中AKT1 和AKT2 是廣泛分布在哺乳動物組織中的。調節性T細胞對于維持自身耐受性和預防自身免疫至關重要，AKT通路在調節性T細胞發育、功能和穩定性中有著重要作用［19-20］。TNF-α是一種具有多種功能的促炎性細胞因子，包括炎癥、免疫、細胞分化、細胞存活與死亡等，大部分是由活化的T淋巴細胞和單核巨噬細胞分泌的。TNF-α可以誘導IL-6 和IL-8 等細胞因子的釋放［21］。IL-6 通常是在免疫、組織再生以及新陳代謝的過程中發揮作用，在先天免疫反應的過程中，IL-6通過感染或組織損傷部位的Toll樣受體(TLR) 識別病原體后，由骨髓細胞（如巨噬細胞和樹突細胞）迅速合成［22］。IL-6 也被確定為調節性T 細胞（Treg）和效應性Th17 細胞之間作用的重要調節因子。與轉化生長因子（TGF）-β結合，IL-6可誘導Th17細胞分化，但是同時也抑制了TGF-β誘導的Treg的發育［23］。STAT3是一種在細胞生長、凋亡、炎癥、癌變等活動中能發揮作用的信號轉錄蛋白，可以調節T細胞增殖和Th17分化，而T細胞中缺失STAT3 可防止中樞神經系統自身免疫性疾病的發展。STAT3 特異性單域抗體在體內能有效抑制Th17 和Th1 細胞，可以治療器官特異性自身免疫性眼病［24］。PTGS2作為一種炎癥介質，不僅是合成前列腺素(PG) 的關鍵酶, 也是前列腺素和血栓烷素的前體［25］。而前列腺素以及血栓烷A2可以形成炎癥介質，進而引發葡萄膜炎癥。

GO 功能結果表明了芍藥甘草治療葡萄膜炎參與了以細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、基因調控等多條生物過程。KEGG 通路結果主要是IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll樣受體信號通路、弓形蟲病、Th17細胞分化等。IL-17 作為一種促炎因子，可以通過靶向視網膜色素上皮細胞導致炎癥的發生，從而引起葡萄膜炎。Th17細胞能夠分泌IL-17A、IL-17F、IL-22 和IL-21。因此，IL-17通路是Th17 細胞下游的主要治療靶點。Toll 樣受體（TLR）是能夠感應病原體的關鍵受體,在對感染和細胞損傷的免疫反應中發揮著核心作用。TLR通過激活NF-κB或MAPK信號通路，能夠活化下游轉錄因子，進而增加IL-6和TNF-α等炎性因子的表達。眼弓形蟲病可以引起感染性葡萄膜炎，只有少數受感染的患者會出現眼部病變，稱為弓形體視網膜脈絡膜炎（TR）。研究證明了IL-6有調節TR炎癥作用。CD4+T 細胞可以分化為T 輔助細胞（Th）或T調節細胞亞群。Th17 細胞屬于Th。IL-6、IL-1β、IL-23和IL-21 等已被證明能促進Th17 細胞的分化，而IL-27、IL-2和IL-4等可以發揮抑制作用。

綜上可知，芍藥甘草湯可能是通過其多種活性成分（槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花素等）作用于AKT1、TNF、IL6、STAT3、PTGS2 等靶點，調控IL-17信號通路、TNF通路、Toll樣受體信號通路、弓形蟲病、Th17細胞分化等通路，從而發揮調節免疫功能、抑制炎癥反應的作用。本研究初步探明芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的相關有效成分及多個作用靶點和通路，為拓展經方臨床應用研究提供一定的理論依據和探索方向。