滇重樓葉片和花萼的SPAD值與葉綠素含量的相關性分析

駱亮仲，李卓蔚，周 濃，夏 李，付旭娟，黃 梅，郭冬琴

（重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）作為延齡草科重樓屬植物，是一種常見的名貴中藥材，根莖入藥，具有涼肝定驚、消腫止痛、清熱解毒的功效，是“熱毒清”“宮血寧”“季德勝蛇藥片”和“抗病毒顆粒”等產品的主要原材料[1]，常用于治療毒蛇咬傷、咽喉腫痛、跌打傷痛等病癥[2]。近些年來，由于中藥產業的迅速發展，市面上對滇重樓的需求大幅提升，導致大量野生滇重樓被采挖空，野生滇重樓的產量已不能滿足人們的需求，因此，人工大規模種植高產優質的滇重樓刻不容緩。

植物光合作用離不開葉綠素，葉綠素含量直接影響綠色植株的光合效率，進而影響植株的營養狀況和生長品質，是植物生長的一項重要指標[3]。目前對葉綠素含量的測定方法主要有SPAD 直接測定法和傳統的丙酮浸提法，后者測定結果較精確，但測定時會損壞葉片，且操作復雜、耗時費力。而前者則可以在不破壞葉片完整性的情況下，快速準確地測定出植株葉綠素含量的相對值[4]，且不受外部環境的影響，因而此法逐漸被學者采用，已在荔枝、柞樹、煙草、蕹菜和江孜沙棘等[5-9]植物中廣泛應用。何麗斯等以高山杜鵑為試驗材料，發現葉片內SPAD 值與葉綠素含量間存在顯著相關性，可以用SPAD 值間接預測植株葉片的葉綠素含量，但大量數據顯示，不同植株或是同一植株的不同部位，其擬合的數學模型仍存在著很大的差異性[10]。目前，關于滇重樓葉片內SPAD 值與葉綠素含量之間的關系尚未見報道，故本試驗以不同生長年限的滇重樓葉片和花萼為供試材料，探究其SPAD 值與葉綠素含量之間的相關性，旨在為生產中利用SPAD 葉綠素儀估測滇重樓葉片營養狀況提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

新鮮的滇重樓葉片采自于貴州省安順市西秀區安順學院科研實驗基地，經安順學院沈昱翔副教授鑒定為滇重樓。試驗于2021 年9 月15 日10: 00—12: 00 進行采樣，隨機選取不同生長年限的植株各10株，每個植株摘取1 片長勢較好、無病蟲害的葉片和花萼，先用SPAD 葉綠素儀測量3 次，并記錄數據；再將其摘下，做好標記，閉光、低溫保存，采用丙酮法測定其葉綠素含量。

1.2 測定方法

1.2.1 SPAD直接測定法

采用葉綠素含量測定儀（CCM200 型）測定葉片和花萼的頂部、中部、底部的SPAD 值，測定時應注意避開葉片的損傷部位，以保證結果的準確性，求取平均值。

1.2.2 丙酮法測定

將上述測定的新鮮葉片和花萼表面擦凈，將其摘下并做好標記，低溫避光保存，除去葉中脈后剪碎。稱取0.1 g 供試樣品放入研缽中，80%丙酮研磨成勻漿，離心機4 000 r·min-1離心15 min，將上清液用80%丙酮定容至20 mL 待測。以80%丙酮為對照，采用紫外分光光度計測定波長645、663 nm 處的OD 值，代入公式計算其葉綠素a、b和總葉綠素含量[11-14]：

式中，Ca、Cb、Ct代表葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量，mg·g-1；D663和D645代表對應波長下的吸光度值；v代表定容體積，mL；W代表稱樣重量，g。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 22.0 軟件處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量比較

比較不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值和葉綠素含量，結果見圖1、圖2。由圖1 可知，隨著種植年限的增加，滇重樓葉片SPAD 值和葉綠素含量的變化趨勢幾乎不同，其中SPAD 值表現為先增加后減少，而葉綠素a 和總葉綠素含量表現為先增加后減少再增加，葉綠素b 含量則表現為先減少后增加，其中，2 年生的葉綠素b 含量最高，4 年生的SPAD 值、葉綠素a 和總葉綠素含量最高。由圖2 可以看出，隨著種植年限的增加，滇重樓花萼的SPAD 值與葉綠素含量都表現為先降低后增加，其中4 年生的SPAD 值、葉綠素b 和總葉綠素含量最高，7 年生的葉綠素a 含量最高。通過比較兩圖可以看出，葉片SPAD 值和葉綠素含量均顯著高于花萼。

圖1 滇重樓葉片SPAD值和葉綠素含量比較

圖2 滇重樓花萼SPAD值和葉綠素含量比較

2.2 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素a 含量的相關性分析

由表1 得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素a 含量之間表現出極顯著相關性，所有函數模型的相關性均達0.4 以上，其中以5 年生（葉片）的函數相關性最大，相關系數高達0.958 4。根據相關系數大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優函數方程分別為對數方程y=0.351 7ln(x)-0.897 8（R2=0.713 2）、指數方程y=0.228 0e0.0249x（R2=0.539 1）、對數方程y=0.294 4ln(x)-0.644 1（R2=0.925 7）、指數方程y=0.163 2e0.0365x（R2=0.879 3）、指數方程y=0.194 6e0.0151x（R2=0.958 4）、線性方程y=0.013 4x+0.127 8（R2=0.607 4）、指數方程y=0.082 8e0.0476x（R2=0.836 4）。

表1 SPAD值與葉綠素a含量的4種函數關系模型

2.3 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素b 含量的相關性分析

由表2 可知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素b含量之間呈極顯著相關，總體相關性均在0.5 以上，其中5 年生滇重樓葉片的SPAD 值與葉綠素b 含量的相關性最大，相關系數高達0.978 5。根據相關系數大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優函數方程分別為對數方程y=1.178 1ln(x)-0.498 6（R2=0.875 0）、指數方程y=1.895 0e0.0230x（R2=0.806 1）、對數方程y=2.231 6ln(x)-4.625 0（R2=0.965 5）、線性方程y=0.059 0x+1.426 1（R2=0.916 8）、對數方程y=1.590 4ln(x)-2.838 5（R2=0.978 5）、對數方程y=2.860 0 ln(x)-5.680 0（R2=0.677 3）、線性方程y=0.131 6x-0.705 2（R2=0.893 5）。

表2 SPAD值與葉綠素b含量的4種函數關系模型

2.4 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與總葉綠素含量的相關性分析

采用4 種函數對SPAD 值（x）和總葉綠素含量（y）的關系進行擬合，結果見表3。由表得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與總葉綠素含量之間呈極顯著相關性，總體相關性均在0.6以上，其中5 年生滇重樓葉片SPAD 值與總葉綠素含量的相關性最大，相關系數高達0.978 8。根據相關系數大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優函數方程分別為對數方程y=1.529 1ln(x)-1.394 9（R2=0.871 6）、指數方程y=2.124 7e0.0232x（R2=0.839 6）、對數方程y=2.525 0ln(x)-5.267 2（R2=0.968 5）、線性方程y=0.068 8x+1.564 7（R2=0.920 7）、乘冪方程y=0.442 7x0.5482（R2=0.978 8）、對數方程y=2.941 1ln(x)-5.503 8（R2=0.731 1）、線性方程y=0.150 7-0.922 4（R2=0.905 2）。分析比較表3、表4 和表5 可以得出，不同生長年限的滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素含量的相關性大小總體都表現為：總葉綠素＞葉綠素b＞葉綠素a，且最大相關性均為5 年生滇重樓的葉片。

表3 SPAD值與總葉綠素含量的4種函數關系模型

2.5 滇重樓葉片SPAD 值、葉綠素含量的實測值與預測值比較

滇重樓葉片SPAD 值和葉綠素含量測定結果如表4所示，2 年生葉片SPAD 值變化范圍為18.433～67.433，葉綠素a、b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.121～0.563 mg·g-1、2.969～4.372 mg·g-1和3.089～4.933 mg·g-1；4年生葉片SPAD值變化范圍為28.533～73.233，葉綠素a、b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.324～0.630 mg·g-1、2.588～4.812 mg·g-1和2.910～5.440 mg·g-1；5年生葉片SPAD值變化范圍為22.967～65.233，葉綠素a、b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.275～0.529 mg·g-1、2.201～3.763 mg·g-1和2.475～4.291 mg·g-1；7年生葉片SPAD值變化范圍為23.133～41.600，葉綠素a、b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.240～0.635 mg·g-1、2.511～4.969 mg·g-1和2.750～5.602 mg·g-1。

表4 滇重樓葉片SPAD值、葉綠素含量的實測值與預測值比較

（續表4）

將測得的不同生長年限滇重樓葉片的SPAD值代入線性回歸方程中，計算葉綠素的預測值，再對實測值與預測值進行統計學檢驗。由表5可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓葉片的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素實測值與預測值間差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預測滇重樓葉片葉綠素含量的絕對值。

表5 滇重樓葉片葉綠素實測值與預測值的P值結果

2.6 滇重樓花萼葉綠素含量的實測值與預測值比較

由表6 可知，4 年生滇重樓花萼SPAD 值變化范圍為10.067～20.267，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量變化范圍為0.288～0.552 mg·g-1、2.482～4.032 mg·g-1和2.770～4.533 mg·g-1；5 年生滇重樓花萼SPAD 值變化范圍為4.533～20.567，葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.202～0.366 mg·g-1、1.800～2.622 mg·g-1和2.001～2.979 mg·g-1；7年生滇重樓花萼SPAD值變化范圍為11.933～25.533，葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量的變化范圍為0.260～0.689 mg·g-1、0.771～3.726 mg·g-1和1.196～4.217 mg·g-1。

表6 滇重樓花萼SPAD值和葉綠素含量的實測值與預測值比較

將測得的不同生長年限花萼的SPAD 值代入線性回歸方程中，計算得出葉綠素的預測值，再對實測值與預測值進行統計學檢驗。由表7 可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓花萼的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素實測值與預測值之間的差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預測滇重樓花萼葉綠素含量的絕對值。

表7 滇重樓花萼葉綠素實測值與預測值的P值結果

由表4 和表6 可以看出，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值和葉綠素含量都各不相同，但葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量大體上都是隨著SPAD 值的變化而變化，即SPAD 值與葉綠素含量的變化趨勢保持一致。

3 小結與討論

SPAD 葉綠素儀是通過測定綠葉在630、690 nm 兩段波長處的吸光率來評估綠葉中葉綠素相對含量的一種手段[15]，在這兩段波長下葉綠素對光的吸收不同，因此可以對葉片傳輸光的數量進行計算，由此得出SPAD 值。采用SPAD 葉綠素儀對植株葉片的葉綠素含量進行估測，不僅可以省時省力，測定還不受溫度和氣候等外部環境因素的影響，在測定過程中也不會對葉片造成損傷[16]。因此，現如今許多科研工作者都開始采用這種簡單的測量方法來取代傳統的紫外分光光度計測量法，也收獲了不少成果，但用此法對滇重樓的研究還未見報道[17-18]。

本研究通過計算滇重樓葉片、花萼葉綠素的相對含量和絕對含量，發現不同生長年限滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量各不相同，總體來看，葉片的葉綠素含量普遍高于花萼，這與高成杰等[19]的研究結果類似。但4 年生的滇重樓，不管是葉片還是花萼，葉綠素含量均高于其他年生，可能是因為受到氣候、土壤、微環境及生長年限等條件的影響[19-21]，可能4 年生滇重樓植株是一個轉折點，有待進一步從光合特性、生理生化等方面深入研究其機制。通過線性、指數、對數和乘冪四個回歸方程[22-24]對葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量進行擬合，發現上述4種函數方程的擬合變量因子均達到極顯著相關性，這說明SPAD值與葉綠素含量間呈極顯著正相關，這與對甘藍、油菜、甜瓜、紅楓等[21,25-26]的研究結果一致。通過對滇重樓葉片、花萼的實測值與預測值進行方差檢驗，發現實測值與預測值間差異不顯著，這與潘靜[27]和李田等[28]的研究結果一致，表明無論是滇重樓的葉片還是花萼均可采用SPAD 值表示葉綠素含量，并且通過相應的回歸方程，可以求出葉綠素含量的絕對值。

本研究表明，可以采用SPAD 葉綠素儀代替復雜繁瑣的傳統手段來測定滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量，這為滇重樓葉綠素含量測定提供了便捷的手段，也為滇重樓的高效種植模式和田間栽培管理提供理論依據。