不同蘋果品種白粉病田間抗性與遺傳多樣性分析

鄭 偉, 吳亞維, 宋 莎, 羅昌國, 王 彬

(貴州省農業科學院果樹科學研究所,貴州貴陽 550006)

蘋果白粉病病原為白叉絲單囊殼(Podosphaeraleucotricha),屬于子囊菌亞門叉絲單囊殼屬,無性階段(Oidiumsp.)屬半知菌類真菌,在我國蘋果產區發生普遍[1]。該病也是貴州省威寧縣蘋果生產中的主要病害之一,芽、嫩梢、花、葉及幼果都會受到侵染,嚴重影響樹勢,降低產量,嚴重制約威寧縣優質蘋果產業的發展[2]。

韓婷婷等以白肉蘋果金冠為母本、紅肉蘋果紅勛1號為父本雜交獲得的F1代為試材,對雜交后代的性狀進行遺傳多樣性分析[3]。李政等以18個新疆野蘋果優系、23個鮮食蘋果品種和7個蘋果砧木品種為材料,對3類蘋果資源的遺傳多樣性及親緣關系進行分析[4]。侯麗媛等以山定子和25份蘋果栽培品種為試驗材料,利用16 對熒光SSR 分子標記對供試材料進行分子鑒定,同時進行了遺傳多樣性分析,并構建了各供試材料的指紋數據和分子身份證[5]。索相敏等利用TRAP(target region amplified polymorphism)分子標記對蘋果屬30 個種和梨屬3 個種共33 份材料進行了遺傳多樣性分析[6]。侯麗媛等利用TP-M13-SSR 技術對供試材料進行指紋圖譜構建,在此基礎上采用GenAlEx 6.501 軟件對供試材料進行親緣關系和遺傳多樣性分析,利用Ntsys 軟件基于Jaccard 系數進行了UPGMA聚類分析[7]。侯麗媛等以赤霞及其親本和部分蘋果栽培品種為試驗材料,利用16 對熒光SSR 分子標記進行分子鑒定的同時構建了指紋圖譜,并進行了遺傳多樣性分析[8]。于少帥等利用15 對特異性SSR 引物對290 份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品進行擴增,并通過分子生物學方法分析其遺傳變異特征與系統發育關系[9]。蘇艷麗等做了SSR標記的開發在蘋果遺傳多樣性中的應用研究[10]。高源等對蘋果屬15 個種的葉綠體DNA變異與遺傳分化進行了研究,對蘋果屬植物種質多樣性的 SLAF-seq 進行了分析[11-12]。有多位學者對蘋果樹腐爛病、莖溝病毒、褪綠葉斑病毒、褐斑病、炭疽病等的遺傳多樣性進行了分析[13-17]。雖然前人在以上方面研究很多,但在不同蘋果品種白粉病田間抗性與遺傳多樣性相關性方面報道還很少。采用ISSR分子標記對16份蘋果送檢樣品進行了DNA鑒定,建立供試種質的DNA指紋圖譜數據庫,并對白粉病田間抗性進行評價和遺傳多樣性分析,了解不同蘋果品種間親緣關系以及與白粉病抗性之間關系,以期為抗性利用、病害防治和新品種選育等提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鑒定材料詳細信息見表1。

表1 材料編號及名稱

取樣時間:2017年5月18日;取樣地點:威寧縣雪山鎮新街果園。

1.2 檢測方法和調查方法

1.2.1 DNA的提取及檢測 采用天根生物科技(北京)有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320-03)提取樣品DNA,操作方法參考試劑盒使用說明,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量后,-20 ℃儲存。

1.2.2 PCR擴增 從33條ISSR引物中篩選出19條譜帶清晰、多態性較好的引物進行PCR擴增,引物序列及其退火溫度見表2。PCR反應體系為 10 μL:3.0 μL ddH2O;0.8 μL 10 μmol/L ISSR引物;1.2 μL 50 ng/μL DNA模板;5.0 μL 2×TaqPCP Master Mix;最后加1滴石蠟油防止蒸發。

表2 ISSR引物序列及退火溫度

PCR反應程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,40～56 ℃退火45 s(退火溫度隨引物而異),72 ℃ 延伸90 s,35個循環;最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 電泳檢測 取5 μL PCR擴增產物,在含GoldviewⅠ型核酸染色劑(0.6 μg/mL)的1.5%瓊脂糖凝膠中以110 V的恒定電壓電泳50 min,以DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]為標準分子量對照,然后在紫外凝膠成像系統中觀察,將所成圖像拍照保存。

1.2.4 發病情況調查 在蘋果葉片采集的當天,對園內的各品種進行白粉病的發病情況調查。

1.2.5 數據統計 ISSR擴增產物按在相同遷移位置上(相同分子量片段)有帶記為“1”,無帶記為“0”,全部以1、0統計建立數據庫,轉換為數值矩陣后,用NTSYSpc 2.10e分析軟件中的Qualitative data進行矩陣分析和SAHN Clustering計算相似系數,并按UPMGA法構建親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA指紋圖譜

篩選出的19 條引物均能擴增出1條以上的清晰條帶,引物的有效擴增率達到了100%,共擴增出101條譜帶,多態性譜帶83條,送檢樣品的指紋圖譜詳見表3,圖1為引物835的擴增譜帶。

表3 送檢樣品DNA指紋圖譜

2.2 樣品間的親緣關系

利用19條引物進行PCR擴增獲得的標記信息,計算16份蘋果樣品的相似性系數。結果表明,被測樣品間相似系數范圍為0.56～0.93,遺傳相似系數見表4。從圖2可以看出,在遺傳距離0.63處供試材料被分成2大類,第1類只有1份材料,為翠秋;第2類包括15 份材料,其中以遺傳距離0.72 為閾值,該類分為5 小類,其中涼香的季節、王富、96-1、華富、布瑞本、涼香、華紅、皮諾娃聚在一起,說明這幾個品種親緣關系較近;天紅2號、紅富士、蜜脆、紅露聚到了一起,說明這幾個品種親緣關系較近;紅蓋露、王林、玉華早富都是單獨的一類,說明這幾個品種都與其他品種的親緣關系較遠。樣品7號(涼香的季節)與8號(王富)的的遺傳距離最小,親緣關系最近,相似系數為0.93;樣品1號(脆秋)與12號(王林)的遺傳距離最大,親緣關系最遠,相似系數為0.56。

表4 蘋果樣品間遺傳相似系數

2.3 不同品種親緣關系與蘋果白粉病抗性的相關性

從圖3和表5可以看出,天紅2號屬于高抗品種,王林屬于中抗品種,涼香的季節、王富屬于抗病品種,96-1、華紅、紅富士屬于感病品種,紅露、華富、涼香、玉華早富、布瑞本、翠秋、皮諾瓦、蜜脆屬于中感品種,紅蓋露屬于高感品種。從圖2和圖3可以看出,涼香的季節與王富親緣關系最近,對蘋果白粉病抗性的差異也較小,都屬于抗病品種。而涼香的季節、王富、96-1、華富、布瑞本、涼香、華紅、皮諾娃這幾個品種親緣關系較近,但對蘋果白粉病抗性的差異卻相差很大,脆秋與王林的親緣關系最遠,但對白粉病的抗性差異卻不是最小的。由此可見不同蘋果品種對白粉病的抗性與親緣關系的遠近沒有太大的相關性。

表5 抗白粉病鑒定分級

3 討論與結論

ISSR是在微衛星標記的基礎上發展而來的分子標記技術[18],能夠揭示植物的遺傳多態性,有效反映出品種間的親緣關系[19]。其引物容易設計,開發費用低,PCR條件更為嚴謹,試驗重復性強,操作過程簡單,不需使用同位素,可以揭示更高程度的DNA多態性[20]。目前ISSR分子標記技術已被廣泛應用在果樹、蔬菜、食用菌、茶葉、中藥材、花卉等植物上進行遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定以及構建遺傳連鎖圖譜等方面[21-31]。研究結果表明,ISSR標記技術是一種非常可靠的有效工具,在蘋果樹種上,ISSR 標記技術主要應用在雜交后代與親本遺傳[32-33]、芽變鑒定[34-35]、砧木資源遺傳多樣性[36-37]、病菌基因多態性的ISSR分析[38]、栽培品種ISSR分析[39]和指紋圖譜構建[40]等。本研究利用ISSR 分子標記技術研究在貴州威寧蘋果園內種植的16 份蘋果栽培品種的遺傳多樣性,篩選出的19條引物均能擴增出1條以上的清晰條帶,引物的有效擴增率達到了100%,共擴增出101條譜帶,其中多態性譜帶83條,多態性比率為82.18%,表明這19條ISSR引物能夠用于16個蘋果品種的遺傳關系分析。進一步遺傳分析表明,在標記檢測范圍內,16份蘋果樣品表現出遺傳差異性,其遺傳距離在0.56～0.93。聚類分析顯示,以相似系數0.63為標準,可將供試的16份蘋果品種劃分為2大類,第1類只有1份材料,為翠秋;第2類包括15份材料,其中以遺傳距離0.72為閾值,該類分為5小類,其中涼香的季節與王富的遺傳距離最小,親緣關系最近,相似系數為0.93;脆秋與王林的遺傳距離最大,親緣關系最遠,相似系數為0.56。但總的來說,遺傳多樣性分析發現群體的相似系數普遍較高,這表明篩選出的ISSR 引物具有一定的代表性,可為之后蘋果的品種資源多態性及抗病性的鑒定提供一定的參考。而不同品種田間抗性的調查數據和親緣關系的分析數據顯示,不同蘋果品種對白粉病的抗性與親緣關系的遠近沒有太大的相關性。