線粒體靶向藥MitoQ對病毒性心肌炎保護作用的相關研究

蔡銀鏈,王圣楠,王耀國,徐 玲

(福建醫科大學附屬第二醫院,福建 泉州 362000)

病毒性心肌炎屬于感染性心肌病,其特征為心肌彌漫性或局限性病變,病毒感染是導致該病的重要原因,最為常見的病毒為柯薩奇B3 病毒(Coxsackievirus B3, CVB3)[1]。當前臨床上仍缺少有效的針對性治療手段,多數患者及時治療后可痊愈,但也有少量患者因病毒性心肌炎急性發作導致心律失常、心力衰竭等情況[2]。

MitoQ是一種線粒體靶向抗氧化劑,近年來被證實在腫瘤、腦線粒體氧化應激中發揮重要作用[3, 4]。此外,其在心臟保護中的作用也逐漸被揭示,如李鵬等通過研究發現MitoQ能夠抑制高糖誘導的心肌細胞線粒體功能障礙[5]。此外也有研究證實MitoQ能夠抑制高糖導致的心肌細胞鐵死亡以及心肌細胞焦亡[6]。另外有關于MitoQ和CVB3的研究發現,MitoQ能夠抑制線粒體活性氧并且抑制CVB3的復制[7]。考慮到CVB3是導致心肌炎的一個重要原因,我們推測MitoQ可能在病毒性心肌炎中發揮作用。

本研究通過CVB3誘導的方式構建病毒性心肌炎小鼠模型,旨在探討MitoQ在病毒性心肌炎治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性BALB/c 小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002];CVB3病毒由武漢大學病毒研究所贈予;MitoQ購自美國Focus biomolecules公司;HE染色試劑盒(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)購自上海碧云天;BCA試劑盒(HR0329)購自北京百奧萊博科技有限公司;Bax抗體(ab216494)、Bcl-2抗體(ab196495)、GAPDH抗體(ab8245)均購自英國ABCAM;ECL顯影液(WBKIS0100購自Millipore;ROS(E004-1-1)和SOD試劑盒(A001-3-2)購自南京建成生物工程研究所;TNF-α的ELISA試劑盒(E-EL-M3060)以及IL-6的ELISA試劑盒(E-MSEL-M0001)購自Elabscience公司。

1.2 CVB3處理小鼠構建病毒性心肌炎動物模型

購買雄性BALB/c 小鼠50只,借助隨機數字表法將小鼠分為對照組、病毒性心肌炎組、MitoQ(2 mg/kg)組、MitoQ(4 mg/kg)組、MitoQ(8 mg/kg)組,每組10只。對照組小鼠通過腹腔注射的方式給予2 mL 0.9%氯化鈉溶液,連續注射7天。另外4組腹腔注射0.2 mL含1.0×106滴度的CVB3病毒以構建病毒性心肌炎模型,腹腔注射病毒6 h后MitoQ治療組小鼠繼續腹腔注射不同濃度MitoQ,處理時間7天,之后采用5%濃度戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉,之后斷頸處死小鼠并且取小鼠心臟和血清標本。

1.3 HE染色檢測小鼠心肌病理情況

將留取的各組小鼠心肌組織在4%多聚甲醛固定24 h,PBS沖洗。脫水以及石蠟包埋組織后制成蠟塊并且依據HE染色試劑盒說明書要求行HE染色。由我院資深病理科醫師對各組心肌組織炎癥分布情況進行評分:無炎性細胞浸潤記為0分,炎性浸潤面積低于25%記為1分,炎性浸潤面積在大于等于25%并低于50%記為2分,炎性浸潤面積大于等于50%并低于75%記為3分,炎性浸潤面積大于等于75%并低于100%記為4分[8]。

1.4 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

收集各組小鼠心肌組織并研磨,之后加入RIPA裂解液進行裂解并且冰上反應30 min。12000 r/min的轉速離心,BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。取50μg蛋白樣本行10%SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜,TBST溶液進行阻斷。加入一抗Bax、Bcl-2,4℃下過夜孵育。次日在室溫下復蘇1h,TBST沖洗后添加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG孵育2小時,TBST沖洗。ECL顯影,Image J對目標條帶進行量化分析,根據GADPH蛋白值進行歸一化。

1.5 試劑盒檢測心肌組織氧化應激指標的影響

收集各組小鼠心肌組織,剪碎后置于冰上勻漿,依據ROS和SOD試劑盒說明書對各組小鼠心肌組織中ROS和MDA水平進行測定。

1.6 ELISA法檢測血清心肌損傷標志物和炎性因子水平

ELISA法對小鼠血清中肌鈣蛋白I(Troponin I,cTnI)、B 型腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平以及炎性因子(TNF-α、IL-6)的水平。取出各組血清樣本并在室溫放置1 h,4℃條件下以2000 r/min的轉速離心10 min,之后取上清液并且依據ELISA試劑盒說明書對cTnI、BNP、TNF-α、IL-6的水平進行檢測。

1.7 統計學分析

數據分析使用SPSS23.0軟件進行,計量資料以均值±標準差的形式表示。兩組間差異比較采用t檢驗,單因素方差分析法與Tukey事后檢驗用于多組間數據比較。P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MitoQ對病毒性心肌損傷的影響

HE染色實驗結果顯示(圖1),對照組小鼠心肌細胞完整、形態正常,可見排列整齊的心肌纖維且不存在炎性細胞浸潤。而模型組小鼠心肌細胞大量壞死、細胞核形狀改變,炎性因子大量覆蓋。隨著MitoQ劑量的增加,心肌細胞病理學變化逐漸改善,心肌細胞壞死、斷裂溶解減少。對比各組病理反應評分發現,與對照組比較,病毒性心肌炎組病理評分增加,隨著MitoQ劑量的增加病理評分也逐漸減少(F=284.8,P<0.0001)。

圖1 HE染色結果觀察和各組病理評分

2.2 各組小鼠血清cTnI 和BNP 水平比較

與對照組比較,病毒性心肌炎組小鼠血清cTnI、BNP 水平均增加(均P<0.05);而與病毒性心肌炎組比較,MitoQ治療組小鼠血清cTnI、BNP水平隨MitoQ濃度的增加呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清cTnI 和BNP 水平

2.3 MitoQ影響心肌細胞凋亡相關因子水平

Western blot實驗顯示,相較于對照組,病毒性心肌炎組凋亡促進因子Bax表達升高而凋亡抑制因子Bcl-2則顯著下調(P<0.05);另外與病毒性心肌炎組比較,隨著MitoQ劑量增大,凋亡促進因子Bax表達水平下降,而凋亡抑制因子Bcl-2表達水平則逐漸上升。見表2。

表2 各組小鼠心肌組織Bax和Bcl-2水平

2.4 各組小鼠心肌組織氧化應激水平比較

與對照組比較,病毒性心肌炎組小鼠心肌組織ROS水平增加,SOD水平降低(均P<0.05)。MitoQ用藥組小鼠隨著MitoQ劑量的增加,ROS水平逐漸降低,SOD水平逐漸增高(均P<0.05)。見表3。表明MitoQ能夠改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織氧化應激。

表3 各組小鼠心肌組織ROS和SOD水平

2.5 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

與對照組比較,病毒性心肌炎組小鼠血清TNF-α、IL-6水平均增加(均P<0.05);而相較于病毒性心肌炎組,MitoQ治療組小鼠血清TNF-α、IL-6水平隨MitoQ濃度的增加呈劑量依賴性降低(均P<0.05)。見表4。提示MitoQ能夠抑制病毒性心肌炎小鼠心肌炎性反應。

3 討論

病毒性心肌炎多發于兒童以及40歲以下青年,尋找能夠有效抑制病毒感染導致的病毒性心肌炎的藥物也具有重要意義[9]。本研究通過實驗證實了線粒體靶向藥物MitoQ能夠抑制病毒性心肌炎小鼠心肌損傷并且減少炎性反應。

本研究首先通過CVB3感染的方式構建了病毒性心肌炎小鼠模型,之后又使用MitoQ對小鼠進行治療,發現MitoQ能夠改善心肌炎小鼠心肌組織病理損傷。cTnI和BNP是心肌損傷標志物,被證實與心功能情況有關[10,11]。而本研究使用MitoQ干預病毒性心肌炎小鼠后,小鼠血清cTnI、BNP 水平降低,這也提示MitoQ對心肌損傷的改善作用。

心肌細胞在人體中屬于不可再生細胞的一種,因此其凋亡程度與心功能也存在密不可分的關系,抑制心肌細胞凋亡對于心臟保護具有十分重要意義[8]。本研究對各組小鼠心肌組織中凋亡相關因子的蛋白表達進行檢測,發現病毒性心肌炎小鼠心肌組織中凋亡相關因子Bax的表達顯著上調而凋亡抑制因子Bcl-2水平被抑制,提示了MitoQ對病毒性心肌炎小鼠心肌細胞凋亡的改善作用。

MitoQ作為一種線粒體靶向抗氧化劑,其發揮作用的重要途徑就是通過自由穿透線粒體,抑制ROS水平從而實現抗氧化和抑制疾病進展的作用[12]。本研究對各組小鼠心肌組織氧化應激水平進行檢測發現相較于病毒性心肌炎小鼠,MitoQ能夠抑制ROS水平增加,促進抗氧化因子SOD水平提高。另外炎性因子檢測結果也證實了MitoQ在抑制小鼠血清炎性因子中的作用。

綜上所述,本研究證實了MitoQ在改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織損傷,抑制氧化應激和炎性反應中的價值,對于病毒性心肌炎的治療具有重要意義。