高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法測定竹葉花椒中2種主要成分的含量*

齊景梁，高必興，，周 娟，茍 琰，，耿 昭，姜衛東△，陳 茜

（1.四川省食品藥品檢驗檢測院·國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，四川 成都 611731；2.成都中醫藥大學，四川 成都 611137）

竹葉花椒來源于蕓香科花椒屬植物竹葉花椒Zanthoxylum armatumDC.的干燥成熟果皮，主要分布于我國西南、華南、華東和華中地區［1-2］，四川地區常稱其為“藤椒”，具有較長的藥用歷史，常作民間藥用或在部分地區作花椒用。竹葉花椒在《本草綱目》《證類本草》《植物名實圖考》等古代本草中均有記載［3-4］，具有溫中止痛、殺蟲止癢之功效，用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛，外治濕疹瘙癢［5-6］。現代研究表明，竹葉花椒主要含有揮發油、酰胺類物質、生物堿、黃酮等成分，具有抑菌、抗炎、殺蟲、麻醉、鎮痛、調節糖脂代謝紊亂、保護胃腸道等功效［7-10］。其中，酰胺類物質是竹葉花椒產生麻味的物質基礎，又以山椒素類物質如羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素為代表［11-12］，具有廣泛的生物活性［13-15］。目前，部分省市的地方中藥材標準如2009年版《湖南省中藥材標準》、1999年版《廣西中藥材標準》、2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》等均收載有竹葉花椒，但由于制訂時間較早，標準較簡單，缺乏含量控制項，不能很好地控制其質量［16-18］。本研究中，分別采用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法測定竹葉花椒中羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素的含量，為完善竹葉花椒藥材質量標準提供科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XP205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01mg）；e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；TU-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HU-20500D型超聲波清洗儀（天津市恒奧科技發展有限公司，功率為400W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

羥基-α-山椒素（批號為RP181113），羥基-β-山椒素（批號為RP180508），均購自成都麥德生科技有限公司，規格為每支20mg，純度≥98.00%；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；甲醇（成都科隆化學品有限公司，分析純）；水為超純水；20批竹葉花椒樣品產地見表1，經四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成主任中藥師鑒定為正品。

表1 樣品產地信息Tab.1 Origin information of sam ples

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil100-5 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，目標色譜峰與鄰近峰均達到完全分離（分離度大于1.5）。羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素理論板數均在20 000以上。色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：分別精密稱取羥基-α-山椒素對照品和羥基-β-山椒素對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羥基-α-山椒素79.11μg、羥基-β-山椒素9.471μg的溶液，即得。

供試品溶液：取供試品粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質量，超聲處理30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10mL，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取2.1.2項下對照品溶液10，20，50μL，稀釋2倍、10倍后的對照品溶液各10μL分別注入液相色譜儀，測定峰面積，并以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，羥基-α-山椒素為Y1=8 397.76X1+135 685.15（r1=1.00），羥基-β-山椒素為Y2=8 893.16X2-18 858.23（r2=1.00）。羥基-α-山椒素與羥基-β-山椒素進樣量分別在0.079 11～3.955 50μg和0.009 5～0.473 6μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.1.2項下對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積。結果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素峰面積的RSD分別為0.42%和0.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一樣品（編號為HY-4），平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量的RSD分別為0.50%和0.65%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一樣品（編號為HY-4），依法制備供試品溶液，室溫下保存，分別于0，2，4，8，12 h時測定。結果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量的RSD分別為0.74%和1.13%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取6份已知含量的樣品（編號為HY-4）粉末（過3號篩）0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入與樣品中的量相當的羥基-α-山椒素對照品和

羥基-β-山椒素對照品，按2.1.2項方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表2。

耐用性試驗：取同一樣品（編號為HY-4），分別考察Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Thermo HypersilGOLD C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Waters Xbridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。結果不同色譜柱測得羥基-α-山椒素含量的RSD為0.25%，羥基-β-山椒素含量的RSD為1.04%，表明方法耐用性良好。

2.1.4 樣品含量測定

取20批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表3。

表2 高效液相色譜法加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery test by HPLC（n=6）

表3 高效液相色譜法含量測定結果（%，n=3）Tab.3 Resu lts of content determ ination by HPLC（%，n=3）

2.2 紫外-可見分光光度法

2.2.1 檢測波長選擇

在紫外-可見分光光度計下分別對羥基-α-山椒素對照品溶液、供試品溶液進行光譜掃描。結果，供試品溶液與羥基-α-山椒素對照品溶液吸收光譜一致，且均于270 nm波長處有最大吸收，故選擇270 nm作為檢測波長。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取羥基-α-山椒素對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羥基-α-山椒素15.82μg的溶液，即得。

供試品溶液：取供試品粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質量，超聲處理30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再精密量取0.3mL，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品溶液0.5，1，2，3，5mL，置10mL容量瓶中，分別加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白對照，照紫外-可見分光光度法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0401），于270 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.166X-0.003，r=1.00。結果羥基-α-山椒素質量濃度在0.7910～7.9100μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2.2項下對照品溶液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白對照，于270 nm波長處測定吸收度，連續測定6次。結果的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一樣品（編號為HY-4），平行制備6份供試品溶液，依法進樣測定。結果6份樣品含量的RSD為0.29%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一樣品（編號為HY-4），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時進樣測定。結果的RSD為0.45%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取6份已知含量的樣品（編號為HY-4）粉末（過3號篩）0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入羥基-α-山椒素對照品溶液（每1mL含羥基-α-山椒素0.196 0mg）25mL，再精密加入甲醇25mL，稱定質量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定，計算回收率。結果見表4。

表4 紫外-可見分光光度法加樣回收試驗結果（n=6）Tab.4 Results of recovery test by ultraviolet-visible spectrophotometry（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取20批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂方法進樣測定。結果見表5。

表5 紫外-可見分光光度法含量測定結果（%，n=3）Tab.5 Results of content determ ination by ultraviolet-visible spectrophotometry（%，n=3）

3 討論

本研究中參考花椒及作為食品的藤椒、藤椒油含量測定的相關研究［19-22］，建立了基于高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法的竹葉花椒含量的測定方法。羥基-α-山椒素在特定條件下會轉化為同分異構體羥基-β-山椒素［23］，本研究中建立的高效液相色譜法同時測定羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素，以二者的總含量進行評價，可避免因同分異構體轉化而產生的誤差。另外，酰胺類物質是竹葉花椒中的一類鏈狀不飽和脂肪酸成分，除羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素外，竹葉花椒中還存在其他結構類似的酰胺類物質［24］，故建立了紫外-可見分光光度法測定酰胺類物質總量的方法。曾考察供試品溶液的提取方法（超聲提取、回流提取）、提取溶劑（水、乙醇、甲醇）及提取時間（10，30，45，60min）。最終，確定甲醇超聲提取30min作為供試品溶液的制備方法。高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法含量測定方法中的供試品前處理相同，制備同一份供試品溶液可供2種方法使用，符合檢驗經濟學的要求。

本研究主要針對竹葉花椒中的麻味物質進行質量控制，但竹葉花椒中還含有揮發性香味物質。采用氣相色譜-質譜聯用方法分析鮮竹葉花椒果實中的揮發性物質，含量最高成分的是芳樟醇、檸檬烯、桉樹腦等［25-27］。對于揮發性物質可否作為指標成分對竹葉花椒藥材進行質量控制及如何控制，需進一步開展系統研究。