WNT2B 與腫瘤免疫浸潤(rùn)及患者預(yù)后的相關(guān)性

樊馨竹，沈藝琳，許濤，羅馳恒，高羽亭（1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞 523808；2.東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；3.東莞市環(huán)境與健康研究所，廣東東莞 523808）

癌癥是全球人口死亡的主要原因之一[1]，且尚未發(fā)現(xiàn)治愈的方法[2]。隨著生物信息學(xué)方法和一些公共數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，可以通過對(duì)基因進(jìn)行泛癌分析來評(píng)估其與臨床預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，以尋求新的治療靶點(diǎn)[3-4]。Wnt 蛋白家族能夠以旁分泌和自分泌方式激活細(xì)胞膜受體，是Wnt 信號(hào)通路的主要組成部分[5]。該信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)過程，與腫瘤等多種人類疾病高度相關(guān)[6]。WNT2B 是刺激經(jīng)典Wnt 通路的Wnt 配體之一[7]，在許多生理和病理過程，特別是在腫瘤的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。在泛癌水平上對(duì)WNT2B 的功能和臨床重要性進(jìn)行全面分析研究鮮見，據(jù)此，本文針對(duì)該基因進(jìn)行了泛癌分析，以探討WNT2B 在癌癥進(jìn)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 WNT2B 基因表達(dá)分析

本文從UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載癌癥基因組圖譜（TCGA）泛癌數(shù)據(jù)集，從中提取ENSG00000134245（WNT2B）基因在各個(gè)樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析該基因在各個(gè)腫瘤樣本中瘤與瘤旁的差異?？紤]到TCGA中正常樣本較少，本研究從UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載TCGA TARGET 基因型-組織表達(dá)（GTEx）泛癌數(shù)據(jù)集，整合GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常組織的數(shù)據(jù)和TCGA 中腫瘤組織的數(shù)據(jù)分析各種腫瘤的表達(dá)差異。

1.2 基因表達(dá)預(yù)后分析

本文從先前發(fā)表在《Cell》上的TCGA 預(yù)后研究[10]中獲得高質(zhì)量的TCGA 的預(yù)后數(shù)據(jù)集，從UCSC 的癌癥瀏覽器中獲取TARGET 隨訪數(shù)據(jù)作為補(bǔ)充，使用R軟件包survival 的coxph 函數(shù)建立Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型以分析基因表達(dá)與每個(gè)腫瘤中的預(yù)后關(guān)系得到森林圖，然后將患者分為高低兩組，用R 軟件包survival 的survfit 函數(shù)分析兩組的預(yù)后差異得到KM 生存曲線。

1.3 免疫浸潤(rùn)分析

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析WNT2B 表達(dá)與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。從TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了33 種癌癥的6 種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的得分?jǐn)?shù)據(jù)，分析基因表達(dá)與這些免疫細(xì)胞得分的相關(guān)性。利用R軟件包ESTIMATE[11]分析各個(gè)腫瘤樣本的基質(zhì)評(píng)分（Stromal score），免疫評(píng)分（Immune score）和綜合評(píng)分（ESTIMATE score）。

1.4 基因突變與表達(dá)分析

從GDC 上下載了經(jīng)GISTIC 軟件[12]處理的所有TCGA 樣本的拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)集，整合樣本的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，使用R 軟件計(jì)算每個(gè)腫瘤中基因在基因組變異和非變異樣本中的表達(dá)差異。

1.5 基因組異質(zhì)性與基因表達(dá)分析

從先前的研究[13]中獲取每個(gè)腫瘤的免疫新抗原數(shù)據(jù)，計(jì)算在各個(gè)腫瘤中新抗原和WNT2B 表達(dá)的相關(guān)性。從GDC 上下載經(jīng)MuTect2 軟件[14]處理的所有TCGA 樣本的單核苷酸變異數(shù)據(jù)集，利用R 軟件包maftools 的tmb 函數(shù)計(jì)算每個(gè)腫瘤的TMB，并整合樣本的TMB 評(píng)分和WNT2B 表達(dá)數(shù)據(jù)，計(jì)算他們之間的相關(guān)性。且從先前的研究[15]中獲取每個(gè)腫瘤的MSI 評(píng)分，整合樣本的MSI 評(píng)分和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，在每種腫瘤中計(jì)算他們之間的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

癌癥基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)均通過log2（x+0.001）轉(zhuǎn)化進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用非配對(duì)的秩和檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的差異顯著性分析，利用kruskal.test 進(jìn)行多組樣本的差異檢驗(yàn)。使用單因素Cox 回歸模型、卡普蘭—邁爾方法進(jìn)行生存分析，并利用logrank test 方法評(píng)估不同組樣本之間的預(yù)后差異顯著性。使用斯皮爾曼或皮爾森相關(guān)系數(shù)來進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 WNT2B 在泛癌中的表達(dá)水平

分析WNT2B 在TCGA 泛癌數(shù)據(jù)中的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，WNT2B 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、膽管癌（CHOL）、混合腎癌（KIPAN）、肝細(xì)胞肝癌（LIHC）和肺鱗癌（LUSC）這7 種腫瘤中高表達(dá)，在多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）、膠質(zhì)瘤（GBMLGG）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、腎嫌色細(xì)胞癌（KICH）、甲狀腺癌（THCA）、直腸腺癌（READ）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）、前列腺癌（PRAD）、結(jié)腸癌（COAD）及結(jié)直腸癌（COADREAD）這14 種腫瘤中低表達(dá)，見圖1A。

本文整合GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常組織的數(shù)據(jù)和TCGA 中腫瘤組織的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示W(wǎng)NT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、胰腺癌（PAAD）、睪丸癌（TGCT）、白血?。ˋLL）、急性髓細(xì)胞樣白血?。↙AML）和CHOL 這9 種腫瘤中高表達(dá)，而在25 種腫瘤中表達(dá)較低，除上述14 種腫瘤類型外，還有宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、腎母細(xì)胞瘤（WT）、黑色素瘤（SKCM）、卵巢漿液性囊腺癌（OV）、食管癌（ESCA）、子宮肉瘤（UCS）、腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、胃和食管癌（STES）、胃癌（STAD）、LUSC 和 LIHC，見圖1B。

圖1 WNT2B 在泛癌中的表達(dá)分析

2.2 WNT2B 在泛癌中的預(yù)后意義

Kaplan-Meier 分析顯示W(wǎng)NT2B 高表達(dá)的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA、TCGA-LAML 中總生存時(shí)間較短，在TCGA-LUSC、TARGET-ALL 中總生存時(shí)間較長(zhǎng)（圖2A～F）。

圖2 WNT2B 表達(dá)與不同腫瘤患者總生存期的相關(guān)性

單變量Cox 回歸分析顯示，WNT2B 高表達(dá)是TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA 和TCGA-LAML 患者總生存期（OS）的危險(xiǎn)因素，是TCGA-LUSC 和TARGET-ALL 患者的保護(hù)因素（圖3A）。此外，疾病特異性生存期（DSS）分析顯示，WNT2B 是TCGA-LGG，TCGA-BLCA 患者的危險(xiǎn)因素，是TCGA-LUSC 患者的保護(hù)因素（圖3B）。無病生存期（DFI）分析顯示，WNT2B 是TCGA-ACC 患者的危險(xiǎn)因素，是TCGA-UCEC 患者的保護(hù)因素（圖3C）。最后，無進(jìn)展生存期（PFI）分析表明，WNT2B是TCGA-LGG、TCGA-BLCA、TCGA-ACC 患者的危險(xiǎn)因素，是TCGA-THYM、TCGA-PAAD 患者的保護(hù)因素（圖3D）。

2.3 WNT2B 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系

結(jié)果顯示W(wǎng)NT2B 表達(dá)與LIHC、PRAD、STAD 和THYM 呈正相關(guān)（P<0.05）。WNT2B 表達(dá)與6 種常見的免疫細(xì)胞得分也具有一定的相關(guān)性，其中最顯著相關(guān)的3 個(gè)腫瘤是COAD、KIRC、LGG（圖4）。在分析腫瘤樣本中WNT2B 表達(dá)與Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的關(guān)系，圖中分別顯示了最顯著相關(guān)的3 個(gè)腫瘤（圖5）。

圖4 WNT2B 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性分析

圖5 WNT2B 與Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的相關(guān)性分析

2.4 WNT2B 表達(dá)與基因突變有關(guān)

整合了樣本的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)和WNT2B 表達(dá)數(shù)據(jù)，以探索每個(gè)腫瘤中基因組變異和非變異樣品中基因表達(dá)的差異。結(jié)果顯示ESCA、STES、STAD、PRAD、LUSC、PAAD、OV、SKCM 和BLCA 這9 種腫瘤中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖6。

圖6 WNT2B 表達(dá)與基因突變的相關(guān)性（*P<0.05，**P<0.01）

2.5 WNT2B 表達(dá)與基因組異質(zhì)性的關(guān)系

結(jié)果顯示在3 種腫瘤中WNT2B 的表達(dá)與TMB顯著相關(guān)，其中在THCA 及ACC 中呈正相關(guān)，在ROADREAD 中呈負(fù)相關(guān)（圖7A）。在8 種腫瘤中發(fā)現(xiàn)WNT2B 與TMB 顯著的相關(guān)性。在KIPAN、ACC等2 種腫瘤中呈顯著正相關(guān)，在COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 與CHOL 等6 種腫瘤中呈顯著負(fù)相關(guān)（圖7B）。在13 種腫瘤中發(fā)現(xiàn)WNT2B 與MSI也存在顯著的相關(guān)性，其中在4 種腫瘤中呈顯著正相關(guān)，如GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC，在9 種腫瘤中顯著負(fù)相關(guān)，如COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 及DLBC（圖7C）。

圖7 WNT2B 表達(dá)與基因組異質(zhì)性的關(guān)系

3 討論

Wnt 信號(hào)通路是重要的信號(hào)通路之一，WNT2B作為經(jīng)典通路分子，在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。已有研究證實(shí)，通過靶向WNT2B 可以抑制膽囊癌和膽管癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[16]，以及延緩膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癌變[17]。沉默WNT2B 能夠增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[18]。然而，目前尚無針對(duì)WNT2B 的泛癌研究。因此在本項(xiàng)研究中，本文整合GTEx 和TCGA 數(shù)據(jù)，詳細(xì)分析WNT2B 在泛癌中的表達(dá)水平、預(yù)后狀態(tài)、免疫浸潤(rùn)和遺傳改變等特征，旨探討WNT2B 與腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性及其在泛癌中潛在的預(yù)后價(jià)值，以尋求新的治療靶點(diǎn)。

本文發(fā)現(xiàn)WNT2B 在泛癌中的表達(dá)存在顯著差異。與正常組織相比，WNT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、PAAD、TGCT、ALL、LAML 和CHOL中是高表達(dá)的，而在GBM、GBMLGG、LGG、LUAD、COAD、COADREAD、BRCA、PRAD、UCEC、THCA、READ、PCPG、BLCA、KICH、CESC、ESCA、STES、STAD、LUSC、LIHC、WT、SKCM、OV、UCS 和ACC 中則表達(dá)較低。研究表明，在化療組中高表達(dá)Wnt2B 的AML 患者預(yù)后更差[19]。此外，Wnt2B 在人胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，且與較低表達(dá)組相比，癌癥組織中Wnt2B 表達(dá)升高預(yù)示著總生存期更短，提示W(wǎng)nt2B 的高表達(dá)可能與癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)[20]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGABLCA 和TCGA-LAML 中總生存時(shí)間較短，而在TCGA-LUSC，TARGET-ALL 中總生存時(shí)間較長(zhǎng)，表明WNT2B 的表達(dá)會(huì)對(duì)不同癌癥患者的預(yù)后造成不同的影響，體現(xiàn)WNT2B 在泛癌中的預(yù)后價(jià)值，顯示其可作為一種預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。

腫瘤微環(huán)境（TME）是規(guī)范和非規(guī)范Wnt 配體的來源，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的信號(hào)通路發(fā)生異常[21]。在TME 中，CAFs 已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)展中起著多種作用[22]。腫瘤免疫微環(huán)境與各種基因的表達(dá)水平有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)WNT2B 的表達(dá)與多種腫瘤的CAFs 浸潤(rùn)呈正相關(guān)，且在LIHC、PRAD、STAD和THYM 中尤為顯著。此外，WNT2B 的表達(dá)與COAD、KIRC 和LGG 中6 種類型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)，并與一些腫瘤的Immune Score、Stromal Score和ESTIMATE Score 相關(guān)。以上結(jié)果均顯示了在不同腫瘤中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)狀態(tài)，提示W(wǎng)NT2B 的表達(dá)可以參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤組織中這一過程，表明WNT2B 在調(diào)節(jié)癌癥腫瘤免疫學(xué)中發(fā)揮了一定的作用。

腫瘤新抗原是腫瘤免疫治療的新興方法之一，主要是由腫瘤細(xì)胞突變產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原，僅在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，具有很強(qiáng)的免疫原性和腫瘤異質(zhì)性[23]。用新抗原合成的疫苗具有多靶點(diǎn)，安全，廣譜等優(yōu)點(diǎn)，它不易引起中樞耐受和自身免疫反應(yīng)，可用于為癌癥患者準(zhǔn)備個(gè)性化疫苗[24]。利用腫瘤新抗原的免疫活性，可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞突變的情況設(shè)計(jì)合成新抗原疫苗，對(duì)患者進(jìn)行免疫注射，達(dá)到個(gè)體化治療的效果。TMB 是腫瘤標(biāo)本中存在的突變總數(shù)，可作為一種生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)多種癌癥類型免疫治療后的生存 率[25]。MSI 是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長(zhǎng)度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。近年來的研究提示MSI 有可能成為評(píng)估腫瘤惡性程度，療效和預(yù)后的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子。在本研究結(jié)果中可看出WNT2B 的表達(dá)在THCA、ACC 和COADREAD 中與腫瘤新抗原相關(guān)，在KIPAN、ACC、COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 和CHOL 中與TMB 相關(guān)，在GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC、COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 和DLBC 中與MSI 有關(guān)，表明WNT2B 表達(dá)水平會(huì)影響癌癥的腫瘤新抗原，TMB 和MSI。

綜上所述，我們應(yīng)用綜合生物信息學(xué)方法，表明WNT2B 表達(dá)可能介導(dǎo)免疫浸潤(rùn)并影響泛癌患者的預(yù)后，展示其作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，并為臨床癌癥治療提供新的靶點(diǎn)。