耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌的耐藥性分析及碳青霉烯酶初篩試驗的應用

閆津津，楊會林，車華濤，陳娟，陳霖（北京大學深圳醫院檢驗科，廣東深圳，518000）

銅綠假單胞菌（PA）又稱綠膿桿菌，為革蘭性陰性菌，廣泛分布于自然界，適宜在潮濕環境、空調、醫院、水池等環境繁殖，易發生醫院感染流行[1]。在人體免疫力低下或菌群失調時更易感染PA[2]。近年來，抗菌藥物耐藥問題愈發嚴重，PA 的臨床耐藥菌株檢出率直線上升，甚至出現多藥耐藥PA。而碳青霉烯類抗菌藥物作為臨床治療多重耐藥菌感染也不例外，其耐藥性藥物包括亞胺培南和美羅培南等[3-5]。PA 的耐藥機制主要包括碳青霉烯酶的產生、外膜孔蛋白的丟失等[6]。耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌（CRPA）的日益增多使臨床感染防控工作更加棘手[7]。研究CRPA 的耐藥機制對防控耐藥菌株的傳播具有重要意義。本研究分析了CRPA 的臨床分布、對抗菌藥物的耐藥性、攜帶的碳青霉烯酶基因型，以期為臨床用藥提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集2020 年1 月至2021 年3 月北京大學深圳醫院住院患者臨床樣本分離的61 株CRPA，菌株于 -80 ℃保存。

1.2 儀器與試劑

Vitek2-Compact 全自動細菌鑒定和藥敏系統（法國梅里埃），Vitek MS 質譜儀（法國梅里埃），CO2恒溫培養箱（美國Thermo-311），藥敏紙片（英國OXIOD），哥倫比亞血平板、MH 平板（廣州迪景），碳青霉烯酶緩沖液（珠海迪爾生物），碳青霉烯酶檢測試劑盒（長沙中生眾捷生物）。

1.3 質控菌株

銅綠假單胞菌ATCC27853 與大腸埃希菌 ATCC25922 為AST 藥敏試驗質控菌株，來自廣東省臨床檢驗中心。產KPC 肺炎克雷伯菌和產NDM 肺炎克雷伯菌為碳青霉烯酶試驗質控菌，來自衛生部臨床中心提供。

1.4 方法

1.4.1 CRPA 菌株鑒定和藥敏試驗 采用Vitek-MS 質譜儀和Vitek2-Compact 全自動細菌鑒定和藥敏系統，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》操作進行細菌分離培養鑒定和藥敏試驗。藥敏試驗結果根據美國臨床和實驗室標準協會2020 版CLSIM10030th 標準判斷。

1.4.2 碳青霉烯酶初篩試驗（1）EDTA 雙紙片增效法：用無菌生理鹽水調制麥氏濁度0.5 的待測菌液，在MH 瓊脂平板上均勻涂布。用滅菌鑷子放置4 張已平衡至室溫的亞胺培南藥敏紙片，紙片間距>24 mm，紙片距平板邊緣>15 mm，在平板背面對應位置分別標記A、B、C、D。將試劑盒中緩沖液R1（乙二胺四乙酸二鈉+氫氧化鈉）、R2（3-氨基苯硼酸）平衡至室溫，A紙片作為空白對照，B 紙片上滴加10 μL 緩沖液R1，C 紙片上滴加10 μL 緩沖液R2，D 紙片上分別滴加 10 μL 緩沖液R1 和R2。孵育18～24 h 后取出平板，測量B、C 紙片抑菌圈直徑，分別與A 紙片對比，直徑比A 紙片擴大≥5 mm，則分別表示該菌株產金屬酶、產絲氨酸酶。（2）免疫層析法：樣本和提取緩沖液在EP管中充分混勻后加到檢測卡樣本孔，樣本中碳青霉烯酶與膠體金偶聯的碳青霉烯酶單克隆抗體反應，在層析作用下沿著硝酸纖維素膜移動，與固定在檢測卡檢測線上的KPC、OXA-48、VIM、IMP 和NDM 型碳青霉烯酶單克隆抗體捕獲，形成“抗體抗原-金標抗體復合物”，并在測試區相應檢測線上出現1 條或多條紅線。

1.4.3 CRPA 耐藥基因測序 將收集的菌株送至深圳市第一人民醫院進行碳青霉烯酶耐藥基因（KPC、OXA-50、VIM、IMP 和NDM）檢測。

1.5 統計學處理

采用WHONET 5.6、Microsoft Excel 2020 及統計學軟件SPSS 26.0 對實驗數據進行統計分析，計數資料以菌株數及百分數表示。

2 結果

2.1 CRPA 的科室分布

61 株CRPA 主要分布ICU 科室24 株、普通病房37 株，其中檢出率排行前3 的是ICU 24 株（39.34%）、呼吸內科9 株（14.75%）、腦外科7 株（11.48%），其余包括神經內科3 株，腎內科、胸外科、運動醫學科各2株，耳鼻喉病區、肝膽胰外科、急診科、脊柱外科、泌尿外科、血液內科各1 株，以及其他科室6 株。

2.2 CRPA 的標本來源

61 株CRPA 的標本來源以痰液為主，共49 株（80.33%），尿液7 株（11.48%），腹水2 株（3.28%），傷口分泌物、血液、引流物各1 株（1.64%）

2.3 CRPA 耐藥性分析

亞胺培南和美羅培南的耐藥率較高，分別達100.00%和78.69%，其次為左氧氟沙星和替卡西林/克拉維酸，均為60.66%，而氨基糖苷類藥物阿米卡星耐藥率最低，為8.20%。其余抗菌藥物耐藥率見表1。

2.4 CRPA 碳青霉烯酶初篩試驗結果

61 株CRPA 碳青霉烯酶初篩試驗檢測出金屬β-內酰胺酶型陽性菌株3 株（1 株既產絲氨酸酶又產金屬酶），絲氨酸酶型陰性菌株29 株；CPPA 耐藥基因測序結果顯示，有3 株CRPA 攜帶金屬β-內酰胺酶IMP-45 基因，32 株CRPA 攜帶絲氨酸酶OXA-50 基因，未檢出KPC、GES 絲氨酸酶型及NDM、VIM 金屬β-內酰胺酶酶型基因。見表2、圖1。

圖1 CRPA 碳青霉烯酶初篩試驗結果

表2 61 株CRPA 碳青霉烯酶初篩試驗結果

3 討論

PA 可導致機體各個部位的感染，肺泡灌洗液、痰液、尿液等其他分泌物均可分離出該菌株[8-9]。本組資料顯示，61 株CRPA 主要分布ICU 24 株（39.34%）、呼吸內科9 株（14.75%）、腦外科7 株（11.48%）。主要原因可能有：以上科室患者往往病情嚴重、病程較長，需頻繁接受靜脈置管、氣管插管等有創傷性的侵襲性操作；同時部分患者長期使用廣譜抗菌藥物，導致自身菌群失調、PA 機會性感染[10-12]。ICU 科室危重患者多，CRPA 在該科室分布較多，臨床應重視對CRPA 的防控工作，預防臨床感染的發生，有助于加快患者的治療進度。有研究顯示，機體呼吸系統易感染PA，其易定植于人體呼吸道，因此該類菌株為患者呼吸道感染的主要病原菌[13]。本研究結果與之描述一致，CRPA 的標本來源以痰液為主，提示CRPA 易感染的部位為呼吸系統。

2015 年一項Meta 分析報道，PA 碳青霉烯耐藥率為8.7%～50.4%[14]。研究顯示[15]，2018 年臨床分離菌中PA 排名第3，分離率達10%，PA 對亞胺培南的耐藥率達30.7%。CRPA 中，最常引起碳青霉烯類耐藥的原因是MexXY-OprM 外排泵表達增加或過表達，其次是菌株OprD 基因減少或缺失，以及MexAB-oprM 有沒有表達增加或過表達[16]。本研究藥敏試驗顯示，亞胺培南和美羅培南的耐藥率較高，分別達100.00%和78.69%；其次為左氧氟沙星和替卡西林/克拉維酸，均為60.66%；而氨基糖苷類藥物阿米卡星耐藥率最低，為8.20%。CRPA 對氨基糖苷類藥物耐藥率最低，可能是其在臨床應用較少或與抗菌藥物聯合應用，延緩其耐藥率的升高[17-18]。Abdallah 等[19]的研究也表明，在短期內控制碳青霉烯類藥物的應用，PA 對碳青霉烯類藥物耐藥率有所下降。鑒于此，在CRPA 感染治療中，應合理使用碳青霉烯類藥物或進行聯合用藥，如β-內酰胺酶聯合氨基糖苷類，或β-內酰胺酶聯合喹諾酮類[20]。根據氨基酸序列的不同，碳青霉烯酶按內酰胺酶分類可分為A 類絲氨酸酶、D 類絲氨酸酶和B 類金屬β-內酰胺酶型。本研究檢測出金屬β-內酰胺酶型陽性菌株3 株，未檢出其他類別金屬酶型基因，說明CPPA 中金屬酶的型別主要為IMP-45；且CPPA 耐藥基因主要攜帶絲氨酸酶OXA-50 基因，但其是否屬于固有耐藥，還需更多的數據驗證。

綜上，CRPA 主要分布于ICU，以痰液標本為主，其菌株多攜帶絲氨酸酶OXA-50 基因；應針對不同科室加強醫院防控措施。醫院應重視對ICU 患者的細菌鑒定，臨床應根據藥敏試驗及患者的病情合理應用抗菌藥物，從而完善醫院感染防控措施，延緩CRPA 耐藥率的升高、控制CRPA 傳播。本研究不足之處：由于檢測條件有限，僅檢測部分常見抗菌藥物的藥敏結果和具有代表性的耐藥基因，未檢測多黏菌素等，藥敏數據和耐藥基因數據具有一定局限性，其臨床價值受限，日后需對CRPA 的耐藥機制及其攜帶的基因型進行更深入的研究。