復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦生長及腸道菌群結(jié)構(gòu)影響研究

郝爽，尤宏爭，張振國，徐曉麗，羅璋，畢相東

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221；2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300392）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國主要的養(yǎng)殖對蝦種類，然而近年隨著集約化養(yǎng)殖快速發(fā)展，養(yǎng)殖病害頻發(fā)，阻礙了產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展[1-2]。由于蝦類不具備獲得性免疫，僅具有天然免疫[3]。因此，提高對蝦自身免疫力及抗病力對于防治病害至關(guān)重要。復(fù)合增強劑能激活機(jī)體自身免疫機(jī)能、增強抗病力，與當(dāng)前研發(fā)的其他化學(xué)藥物和疫苗相比，具有綠色、高效、安全等優(yōu)點[4-6]。目前養(yǎng)殖業(yè)中常用的免疫增強劑種類主要有中草藥、多糖類、維生素等，但相關(guān)研究多以單方制劑為主，對復(fù)方制劑研究較少[7-8]。

本研究使用的復(fù)合免疫制劑主要成分為β-葡聚糖、中草藥、維生素C 磷酸酯和維生素B 等，試驗對象為凡納濱對蝦，通過開展養(yǎng)殖投喂試驗，研究復(fù)合免疫制劑對機(jī)體生長和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為復(fù)合免疫制劑在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與飼養(yǎng)管理

本研究使用的復(fù)合免疫制劑主要成分為酵母多糖、大黃、黃岑、黃柏，以及維生素類，其中中草藥購于甘肅卓尼，其他原料購于天津本地。將基礎(chǔ)飼料粉碎后，添加0.5%復(fù)合免疫制劑混勻，用小型餌料機(jī)壓制成免疫飼料備用。

試驗用健康凡納濱對蝦由天津市晟淼水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，初始體長（6.88±0.53）cm，初始體質(zhì)量（2.22±0.32）g。試驗開始前先對試驗用蝦進(jìn)行常規(guī)病原檢測，確保其機(jī)體處于健康狀態(tài)。凡納濱對蝦暫養(yǎng)14 d 后，隨機(jī)分為對照組（A1 組）和試驗組（A2組），每組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)200 尾蝦，分別置于容量為1 000 L 的養(yǎng)殖桶中，水溫（24.5±0.5）℃，鹽度25，連續(xù)充氧保持含量5 mg·L-1以上。

A1 組凡納濱對蝦投喂基礎(chǔ)飼料，A2 組投喂免疫飼料。試驗開始前禁飼24 h，試驗期間每日投飼3次，投喂比例分別為20%、20%、60%，日投餌量為凡納濱對蝦體質(zhì)量的10%，養(yǎng)殖試驗周期28 d。

1.2 樣品采集與處理

試驗開始后分別于第7、14、21、28 天采集樣品，每個重復(fù)隨機(jī)抽取5 尾蝦，用無菌生理鹽水漂洗剖取出的對蝦完整腸道，同一重復(fù)5 尾對蝦腸道裝入無菌冷凍管中合并為一個樣本，置于-80 ℃保存，以備腸道菌群檢測分析。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，統(tǒng)計存活率。每個重復(fù)隨機(jī)抽取30 尾對蝦，測量體長、體質(zhì)量，參照文獻(xiàn)[9]方法計算生長性能指標(biāo)。

1.3 腸道微生物基因組測序分析

提取對蝦腸道微生物基因組DNA，針對細(xì)菌16S rRNA 基因V3+V4 區(qū)片段設(shè)計通用引物，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收純化。基于Illumina Nova 平臺對構(gòu)建的小片段文庫進(jìn)行雙末端測序，Reads 拼接、過濾后，基于97%一致性將序列聚類成為運算分類單元（OTUs），通過序列比對到Silva132 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生長性能數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 22.0 軟件獨立樣本t 檢驗進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為0.05，極顯著性水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦生長的影響

投喂復(fù)合免疫制劑28 d 后，凡納濱對蝦各項生長指標(biāo)見表1。試驗組（A2 組）凡納濱對蝦的終末體長、終末體質(zhì)量、增質(zhì)量率和體長增長率均高于對照組（A1 組），但差異不顯著（P＞0.05）；A2 組對蝦存活率顯著高于A1 組（P＜0.05）。

表1 復(fù)合免疫制劑對對蝦生長性能的影響

2.2 復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

各組對蝦腸道菌群在門水平上組成成分主要有：變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、微菌門（Verrucomicrobia）等。試驗期間，不同門類菌群在各組腸道中比例發(fā)生變化，但變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門總含量均在90%以上，占主要優(yōu)勢（圖1）。

圖1 不同時間點兩組樣本在門水平上的物種豐度

各組對蝦腸道菌群在屬水平上組成成分主要有：假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、弧菌屬（Vibrio）、黃桿菌屬（Tenacibaculum）、魯杰氏菌屬（Ruegeria），以及其他（Others）等。試驗期間，各組菌群比例發(fā)生變化，但同一采樣時間點，試驗組（A2組）弧菌屬相對豐度均低于對照組（A1 組）；第28天，A2 組黃桿菌屬相對豐度低于A1 組；隨養(yǎng)殖時間的延長，A2 組假交替單胞菌屬相對豐度逐漸增高；第21 天和28天，試驗組假交替單胞菌屬相對豐度均高于A1 組（圖2）。

圖2 不同時間點兩組樣本在屬水平上的物種豐度

3 討論與結(jié)論

3.1 復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦生長的影響

大量研究表明，復(fù)合免疫制劑能促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長，但促生長的效果與復(fù)合免疫制劑的種類、添加量、投喂策略以及水產(chǎn)動物品種等都有密切關(guān)系[10-11]。

周岐存等[12]在凡納濱對蝦飼料中添加維生素C2 磷酸酯，養(yǎng)殖前4 周對蝦生長水平顯著提高；郭文婷等[13]試驗表明，凡納濱對蝦增質(zhì)量率與飼料中富含黃酮類化合物的中草藥制劑濃度呈正相關(guān)；趙紅霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦體質(zhì)量、增質(zhì)量率和特定生長率，隨著飼料中β-1，3 葡聚糖添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。本研究中，連續(xù)投喂0.5%添加量的復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦生長無顯著影響。王蕓等[15]用復(fù)方中草藥飼喂凡納濱對蝦，連續(xù)投喂組的生長性能顯著優(yōu)于對照組，但間斷投喂組與對照組之間無顯著差異；Luo 等[16]研究表明，間隔投喂或連續(xù)投喂200 mg·kg-1的β-葡聚糖對凡納濱對蝦生長速度均沒有促進(jìn)作用；熊家等[17]研究表明，連續(xù)投喂8 周不同添加水平的酵母水解物，凡納濱對蝦的增質(zhì)量率和特定生長率均未產(chǎn)生顯著變化，與本研究結(jié)果相似。不同試驗結(jié)果可能與免疫制劑成分配比、添加劑量，以及免疫制劑投喂策略相關(guān)。

3.2 復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

對蝦腸道微生物菌群與機(jī)體免疫、營養(yǎng)、胃腸發(fā)育等生理過程密切相關(guān)[18]，菌群穩(wěn)定有益于保持腸道正常消化、吸收，維持腸道的屏障功能，菌群結(jié)構(gòu)優(yōu)化有助于提高機(jī)體免疫力和抗病力[19-20]。

已有研究表明，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門是健康凡納濱對蝦腸道中門水平上的的主要指示生物[21-22]。本研究中，在門水平上，試驗組和對照組對蝦腸道菌群各種類相對豐度有所不同，但菌群種類組成比較相似，試驗期間兩組對蝦腸道中變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門均處于優(yōu)勢地位。黃欽城等[23]在飼料中添加殼聚糖和霉菌毒素，各組凡納濱對蝦腸道中不同門類菌群比例發(fā)生了變化，但每組變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門總含量均達(dá)90%左右，這與本研究結(jié)果相似，說明飼料中添加0.5%復(fù)合免疫制劑，不會破壞對蝦腸道主體菌門類的優(yōu)勢地位。

弧菌屬和黃桿菌屬在水生動物養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在，是健康對蝦中腸道中常見菌群[24]，其中有些種類是條件致病菌，大量繁殖可能增加對蝦感染疾病的風(fēng)險[25-27]。假交替單胞菌屬能分泌多種生物活性物質(zhì)、抗生素及胞外酶等，具有抗菌、溶菌、降解纖維素等功能[28]。Sonnenschein 等[29]對全球多地海水中的一種魯杰氏菌（Ruegeria mobilis）進(jìn)行了功能基因組分析，發(fā)現(xiàn)其基因組中存在大量原噬菌體和毒素抗毒基因，認(rèn)為具有作為水產(chǎn)益生菌開發(fā)的潛力。本研究中，在屬水平上，兩組對蝦試驗期間腸道菌群中占優(yōu)勢地位的主要有假交替單胞菌屬、弧菌屬、黃桿菌屬、魯杰氏菌屬，這與許多學(xué)者研究結(jié)果相似，但組間菌群結(jié)構(gòu)存在差異：同一采樣時間點，試驗組弧菌屬相對豐度均低于對照組；第28 天，試驗組假交替單胞菌屬相對豐度達(dá)到最高，而柱狀黃桿菌屬相對豐度低于對照組。試驗過程中，組間菌群結(jié)構(gòu)的變化差異，說明飼料中添加免疫制劑能增加有益優(yōu)勢菌群豐度，抑制條件致病菌增殖，有效調(diào)節(jié)蝦類腸道微生態(tài)平衡。

綜上，在本試驗條件下，連續(xù)投喂28 d 復(fù)合免疫制劑，可以改善凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高養(yǎng)殖成活率，且不會對生長性能產(chǎn)生負(fù)面影響。由于本研究中只設(shè)置了一種添加劑量和投喂方式，在其他添加劑量及投喂策略下，復(fù)合免疫制劑對凡納濱對蝦的生長指標(biāo)影響，還有待進(jìn)一步研究。