蜂膠對齲病防治作用的研究進展

張倫齊,王 琨,張凌琳,2

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物芽孢和分泌物中提取,并與其分泌的蠟、花粉等混合形成的具有黏性的膠狀物[1]。作為一種傳統中藥成分,蜂膠在醫學領域的用途在近年來得到越來越多學者的關注,并已證明其具有多種生物學活性,如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗癌等,在口腔保健、食品安全等方面得到廣泛應用。

齲病是多年來口腔醫學研究的熱點問題,對人們的口腔及全身健康有著廣泛危害。全國第四次口腔健康流行病學調查結果顯示,12歲兒童恒牙齲患率為34.5%,較之上次普查結果,兒童患齲率呈上升趨勢; 65～74歲組恒牙患齲率為98%,附著喪失檢出率為74.2%,且導致老年人牙列缺損的主要誘因仍為齲病[2]。目前,齲病的防治手段主要是機械法去除牙菌斑以及藥物治療,常用的防齲藥物包括氯己定和氟化物,但由于其廣譜抗菌的作用,常常會導致口腔內菌群失調;同時,氯己定容易導致色素沉積[3];而氟化物使用不當則有慢性氟中毒的風險。隨著人們對口腔保健重視程度的不斷提高,尋找更加安全且行之有效的齲病防治手段是當前口腔疾病研究領域的熱點內容。本文將針對蜂膠及其有效成分的生物活性及其在齲病防治方面的作用進行綜述。

1 蜂膠來源及其主要成分

蜂膠是由蜜蜂通過其下顎腺分泌物與從植物組織中收集到的樹脂混合而產生的一種天然且無毒的黏性膠狀物,在蜂巢中起密封和殺菌的作用[1]。

蜂膠的化學組成十分復雜,來自不同產地的蜂膠內成分已檢測出超過800種[4],就目前的研究而言,其主要成分包括:樹脂(50%～70%)、蠟(30%～50%)、花粉(5%～10%)、氨基酸、糖、維生素、類黃酮、芳族化合物等[1,5]。蜂膠中成分除了受植物的影響外,同樣受到產地及氣候等因素影響,故不同產地的蜂膠其活性成分也有一定的差別。國外常用的蜂膠為熱帶蜂膠,如巴西綠蜂膠,其主要活性成分為烯萜類和脂肪酸[6];國內研究常使用的蜂膠多為以伊利黑蜂膠為代表的溫帶型蜂膠,其主要活性成分為咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)[7]。

作為一種天然物質,蜂膠的安全性是值得信賴的。有研究表明,蜂膠對小鼠的半數致死劑量(LD50)大于300 mg/kg[8]。就目前的研究來看,蜂膠對人體最大的危害是對蜂膠或其中的成分如花粉等存在過敏反應[9],而對于大多數種類的蜂膠,正常劑量下的體內外研究結果均表明其對人體或小鼠具有較小的不良反應。

2 蜂膠的生物學活性

蜂膠具有一定的抗氧化活性,這主要與其高含量的酚類物質有關。類黃酮是蜂膠中的主要酚類物質,與蜂膠的生物學活性密切相關,其含量的多少被認為是評估蜂膠質量的標準。這些黃酮類物質很大程度上決定了蜂膠抗氧化、抗菌、抗真菌、抗齲和抗癌特性[10]。

2.1 抗菌性能

蜂膠的抗菌性能主要表現在其對不同種類細菌的抑菌作用或殺菌作用,其機制可能與改變細菌細胞膜的通透性,抑制細菌中三磷酸腺苷(ATP)的產生有關[11]。對臨床上常見的革蘭氏陽性菌——金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,蜂膠表現出良好的抗菌性能,Al-Ani等研究表明,蜂膠對金黃色葡萄球菌的平均最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.08～2.50 mg/mL[12]。蜂膠對革蘭氏陰性菌也有一定的抗菌性能[13],但根據現有研究,蜂膠對革蘭氏陽性菌的抗菌作用更強[12]。

2.2 抗病毒性能

2.3 抗真菌作用

白念珠菌是最常見的真菌病原體之一,并對現有抗生素耐藥性逐漸增加[16]。Gucwa等從臨床患者中分離出了69種白念珠菌,發現大多數波蘭蜂膠的提取物對菌株有抑制作用,且能減少相應菌株的單菌種生物膜的形成量,進一步研究發現蜂膠提取物與氟康唑聯合使用能增強對白念珠菌抑制作用[17]。另有研究發現,巴西蜂膠提取物-13型可導致念珠菌屬生物膜結構在低濃度(<0.9 μg/mL)時破裂,破壞其完整性和結構[18]。

2.4 抗癌作用

孫小英等使用黑風蜂膠提取物可對肝癌(H22)移植瘤模型小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用,并且抑制腫瘤的作用對劑量存在一定的依賴性,推測其機制為恢復病鼠的自身免疫功能[19]。Seyhan等分離了蜂膠內的各種組分,發現其中的黃酮類化合物對乳腺癌細胞有顯著的抑制效果,其中以高良姜精最顯著,在5～30 μg/mL劑量下顯示出顯著的細胞毒性作用[20]。

2.5 抗氧化作用

氧化應激是指在機體抵抗致病菌時,產生的活性氧超過機體抗氧化劑所能代謝上限,進而導致的組織損傷[21]。蜂膠中的CAPE具備較好的抗氧化作用,其主要的作用機制可能與核因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路有關;St?hli等的研究證明CAPE可以通過消除自由基,減少細胞凋亡、氧化應激反應來緩解記憶障礙并保護海馬體[22]。在急性肝炎大鼠模型中,CAPE可以通過恢復谷胱甘肽水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性減少肝損傷[23]。

3 蜂膠的防齲作用研究

齲病是由致齲菌引起的慢性感染性疾病,是口腔內多種微生物與碳水化合物發生復雜的相互作用,產生有機酸使牙釉質、牙本質脫礦的結果。在眾多與齲病發生密切相關的致齲菌中,變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)、乳桿菌、放線菌發揮了主要作用,除產酸外,這些致齲菌還可合成細胞外多糖,形成多菌種生物膜,并黏附于牙面上[24]。

3.1 蜂膠防齲的機制研究

3.1.1 對致齲菌的抑制作用

Anauate Netto等一項為期28 d的隨機對照試驗表明,在減少和抑制變形鏈球菌和乳桿菌的數量方面,2%蜂膠提取物沖洗效果優于1.2%氯己定漱口液沖洗,且在第45天,仍觀察到蜂膠抑制S.mutans唾液含量的殘留作用[25]。Oda等的研究發現,巴西綠蜂膠(BGP)在較低濃度下對S.mutans的生長即表現出抑制作用,當BGP達到2 g/L時可以明顯抑制S.mutans的生長[13],Asgharpour等也測得西班牙蜂膠提取物對S.mutans的MIC值為3.1～25.0 μg/mL[26]。另有研究發現,蜂膠的丙酮提取物對乳酸桿菌顯示MIC為6.3 μg/mL[27]。

口腔中常駐的致齲菌大多含有高濃度乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH),該酶能夠分解食物中的糖,并形成酸性環境,誘發牙釉質的損傷。有研究發現蜂膠乙醇溶液對浮游狀態及生物膜狀態下的S.mutans與遠緣鏈球菌的LDH活性抑制作用顯著,且乳酸脫氫酶對蜂膠提取物的敏感性比氟化鈉更高[28]。另有研究發現,CAPE能顯著抑制S.mutans的產酸能力,且抑制能力呈現劑量依賴性[29]。國內外的研究結果有所不同可能與所使用的蜂膠產地不同有關[6-7]。

同時,葡糖基轉移酶(glucosyltransferases, Gtfs)膜內原位合成的葡聚糖是致齲菌產生毒力的另一因素[30]。有學者研究發現,在亞MIC濃度下,槲皮素能顯著抑制非水溶性胞外多糖的產生[29,31]。Martins等對比0.12%氯己定和3%紅蜂膠提取物對細胞外多糖的影響,兩者均可降低胞外多糖的含量,但氯己定組中觀察到胞外多糖含量降低更顯著,研究者將這種效應歸因于細菌死亡,而非氯己定抑制細胞外多糖形成[32]。Roach等也發現,比起單獨使用氟化鈉,蜂膠提取物在與氟化鈉聯用時,可增加葡聚糖,特別是水溶性葡聚糖的降低量,達到與0.12%氯己定相似的效果[33]。

（1）建立以技術創新引領綠色金融系統協作發展的戰略思維。環保科技創新對推動發展方式轉變和經濟結構調整、解決污染治理具有重要作用，為我國經濟新舊動能轉換提供了重要的動能。政府應在推進綠色金融的發展過程中建立更多的綠色技術研發平臺，從而降低環保企業的研發費用，同時加快科技創新成果的轉移和轉化，從而能夠更快地推動環保企業的技術創新和升級。另外，要加快建立綠色生產的法律制度和政策導向，加大對通過技術創新開展綠色化生產的金融支持力度，對積極開展綠色金融業務、支持環保企業的商業銀行等金融機構給予相應的獎勵補助。

3.1.2 對致齲生物膜形成的抑制作用

此前的研究已經證明,致齲菌的黏附機制分為蔗糖獨立性黏附和蔗糖依賴性黏附。前者通常指黏附素發生非特異性黏附,后者則指Gtfs利用蔗糖合成的葡聚糖與葡聚糖結合蛋白(glucan-binding protein,Gbps)結合[5,34],蜂膠提取物及其多種化學成分主要通過對后者的抑制作用抑制生物膜的形成。Veloz等報道了蜂膠提取物在終濃度為0.4 mg/mL時,幾乎完全抑制了S.mutans的黏附作用[35]。另有研究認為芹菜素通過干擾Gtfs,特別是葡糖基轉移酶B(glucosyltransferase-B,GtfB)、葡糖基轉移酶C(glucosyltransferase-C,GtfC)活性,減少以α-1,3糖苷鍵為主的葡聚糖的生成,并降低了S.mutans對玻璃表面的黏附作用,從而對生物膜形成產生影響[36]。蜂膠中提取的槲皮素可調節relA、brpA、gtfC、covR、comDE和smu630基因的表達,并與1-脫氧野尻霉素協同作用,減少表面抗原Ag Ⅰ/Ⅱ的數量,阻礙細菌間相互作用,從而阻止生物膜形成[37]。Niu等推測,蜂膠中的CAPE通過抑制Gtfs相關調節基因(如VicK、VicR和CcpaA)的表達,減少了蔗糖依賴性黏附,從而抑制致齲生物膜的形成,并且這種抑制呈現劑量依賴性[29]。

3.1.3 對成熟生物膜的清除作用

成熟期的生物膜可以提高致齲菌對機械和藥物清除的抵抗力,生物膜中的細菌對抗生素等藥物的抗性通常是浮游菌的10～1 000倍,并能維持致齲菌產生的酸性環境,具有更高的毒力作用[38-39],生物膜成熟后,通過破壞其結構可促進其在載體表面的脫落。Zeng等使用從蜂膠中提取出的槲皮素處理成熟期S.mutans生物膜后,發現生物膜中的活細胞數量明顯減少,掃描電鏡顯示,與對照組相比,處理組生物膜結構疏松多孔,細胞外基質間連接明顯減少[31]。有研究證明,土耳其蜂膠對乳酸桿菌和放線菌的單菌最小生物膜清除濃度分別為512和128 μg/mL ,且對其他致齲相關的致病菌生長具有一定抑制作用[26]。也有研究用巴西紅蜂膠處理形成7 d后成熟的多菌種生物膜(包含鏈球菌屬、放線菌屬)24 h,以模擬阿莫西林全身用藥的情況,發現400 μg/mL的蜂膠提取物顯著降低生物膜的代謝活性和生物膜中鏈球菌的數量,并減小生物膜厚度[40]。

3.2 蜂膠防齲的應用研究

根據蜂膠對S.mutans等致齲菌多方面的抑制作用,可以考慮將其添加進牙膏、漱口水、涂料中,從而抑制齲病的進展[41]。

3.2.1 漱口水

Dehghani等使用1%蜂膠漱口水作為試驗組進行雙盲試驗,結果顯示,使用蜂膠漱口水對齦上菌斑的形成有顯著抑制作用,能顯著改善口腔健康問題[42]。Bapat等在一項為期3個月的研究中發現,蜂膠漱口水對牙菌斑的抑制作用與氯己定相似[43]。在體外實驗中,0.8%紅蜂膠漱口水對血鏈球菌和S.mutans有一定的抑制作用,但不能抑制其胞外多糖的產生[44]。Vanni等的研究卻認為,蜂膠漱口水對S.mutans形成的單菌種生物膜沒有抑制作用[45]。

3.2.2 牙膏

Smolarek等通過抑菌環實驗對市場上現有的中草藥牙膏進行對比分析,發現含有蜂膠以及白千層的牙膏對S.mutans的抑制效果最佳,產生較大直徑的抑菌環[46]。同時,Demir等的研究發現,含有蜂膠的牙膏僅對S.mutans有抑制作用,但對血鏈球菌和糞腸球菌無作用[47]。Vanni等的研究中,含有0.9%蜂膠的牙膏對S.mutans的抑制作用弱于0.12%氯己定[45]。體內研究方面,Wiatrack等將茶樹油和蜂膠提取物添加到牙膏內,發現與普通牙膏相比,在試驗28 d后,前者可顯著降低受試者的菌斑指數,以及包括放線菌、乳桿菌在內的細菌數量[48]。在一項為期35 d的隨機對照研究中,添加3%蜂膠提取物的牙膏可顯著降低正畸治療患者的牙菌斑指數[49]。

3.2.3 涂料

DE Luca等研究了蜂膠涂料對感染S.mutans雌性大鼠的抗齲作用,結果表明,含蜂膠涂料可以顯著降低大鼠光滑面齲的發生率,且與2.26%的含氟涂料有相似的效果,但蜂膠涂料對牙本質齲和窩溝齲均沒有良好的防治效果[50]。另有研究2.5%巴西紅蜂膠涂料預防兒童齲齒的抗菌功效,選取了50名高患齲風險兒童,分別給予5%含氟涂料、2.5%蜂膠涂料,蜂膠涂料在使用后90 d內可有效控制口腔中S.mutans的增殖[51]。

上述研究表明蜂膠可以以牙膏、漱口水、涂料等形式作用于口腔局部發揮效果,在未來可以作為氯己定天然替代藥物。但是由于蜂膠成分的復雜性,研究結果存在差異。在正式投入使用前,仍需尋找適用于防治齲病的蜂膠種類,并通過動物和人體研究來確定其安全劑量。

4 總結與展望

隨著人們對口腔健康的關注度日益提升,蜂膠作為具有多種生物學活性的天然產物,可以通過加入漱口水、牙膏、涂料等口腔護理或保健品中發揮抗齲作用。然而,就目前的研究進展來看,蜂膠能否成為穩定且高效的物質還需要進一步的研究論證,并且不同產地蜂膠化學成分差異可能導致不同的研究結果和生物效應,也需要進一步驗證蜂膠發揮作用的成分及其機制。盡管蜂膠具有很高的安全性且相對無毒[8],但仍有過敏反應等不良反應的報道,使用蜂膠的安全性仍然有待考證[9]。

綜上所述,蜂膠在齲病防治領域具有很廣闊的應用前景,未來有關蜂膠研究應兼顧其成分機制和安全性。在此基礎上,蜂膠有望成為一種能夠防治齲病的天然藥物。