鱘魚內源絲氨酸蛋白酶對肌原纖維蛋白凝膠性能的影響

周 猛，洪 惠，羅永康，譚雨青

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

鱘（Acipenser sinensis）又稱鱘龍，是現存歷史最久遠的魚類之一，2020 年中國鱘魚總產量達104 280 t[1]。鱘魚肉質鮮美，蛋白質豐富，無肌間刺和硬骨，冷凍及加工制品也便于運輸，因此冷凍鱘魚及鱘魚加工制品的消費群體尤為龐大。目前已嘗試以產籽鱘魚肉為原料進行魚糜制品加工[2]，但鱘魚魚糜制品凝膠強度低的問題亟待解決[3]。在魚糜制品加工中，原料種類、加熱條件、擂潰條件及內源酶等均影響魚糜凝膠性能[4]，而內源酶是極為重要的因素之一[5]。魚糜加工過程中，通過漂洗可有效提高鱘魚魚糜凝膠的凝膠性能[6]。但漂洗魚糜在50～60 ℃的升溫過程中依然出現凝膠劣化現象。

耐熱型且不易在漂洗過程中除去的肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶（Myofibril-bound serine proteinase，MBSP）是導致魚糜凝膠劣化的關鍵內源酶[7]。研究表明，當鱷蛇鯔（Saurida wanieso）肌原纖維蛋白與其MBSP在55～60 ℃下孵育時，肌球蛋白重鏈降解最為明顯[8]，鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）肌原纖維蛋白與其MBSP 孵育的最適降解溫度是50～60 ℃[7]。金線魚（Nemipterus virgatus）魚糜經過6 次漂洗后MBSP 活力仍無顯著降低[9]。即使在冷凍鱷蛇鯔魚糜中，MBSP穩定性仍很高，因此MBSP 對冷凍魚糜的品質也造成巨大影響[10]，但目前對于鱘魚MBSP的研究較少。筆者研究鱘魚內源絲氨酸蛋白酶對肌原纖維蛋白凝膠性的影響與作用機制，為鱘魚魚糜加工及其品質提升提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱘魚購自北京健翔橋農貿市場。3 種蛋白酶抑制劑：絲氨酸蛋白酶抑制劑，4-(2-氨基乙基)-苯-磺酰氟（Pefabloc SC）；半胱氨酸蛋白酶抑制劑，E-64（L-trans-3-Carbo xyoxiran-2-carbonyl-L-leucylagmatine）、Pepstatin A(N-(3-methyl-1-oxobutyl)-L-valyl-L-valyl-(3S,4S)-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-N-[(1S)-1-[(1S)-2-carboxy-1-hydroxyethyl]-3-methylbutyl]-Lalaninamide)；金屬蛋白酶抑制劑，乙二胺四乙酸（EDTA）。Pefabloc SC 購自上海麥克林生化科技有限公司，E-64、Pepstatin A、EDTA 購自北京索萊寶科技有限公司，所有抑制劑均溶解在0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl 的緩沖液(pH 8.0)中。7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 購自Peptide Inst，溴化鉀購自阿拉丁試劑（上海）有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

UV-2600 紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；F97pro 熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司）；Frontier傅里葉紅外光譜儀（帕金埃爾默股份有限公司）；TA DHR-2 流變儀[美國TA 儀器沃特世科技（上海）有限公司]。

1.3 蛋白酶抑制劑對蛋白質降解的影響與粗酶制備

1.3.1 肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein,MP）制備 根據曹敏杰等[11]方法并稍作調整，取魚肉，按質量（g）體積（mL）比1∶4 加入20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，在10 000 r/min 速度下均漿1 min，在4 ℃、8 000g條件下離心15 min，轉速，收集沉淀。重復上述操作3 次后，所得沉淀按質量（g）體積（mL）比1∶4 加入0.6 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）溶解，進一步均質，得鱘魚MP 溶液。所有實驗步驟如無特殊要求均在4 ℃下完成。

1.3.2 蛋白酶抑制劑對蛋白降解的影響 抑制劑濃度選擇：根據不同抑制劑選擇有效抑制濃度范圍內最高濃度與最低濃度[12]，E64中間加設10 mmol/L的濃度梯度，即Pefabloc SC，0.4、4.0 mmol/L；EDTA，1、10 mmol/L；E64，1、10、100 μmol/L；Pepstatin A，1、10 μmol/L。

實驗方法：根據Takahashi 等[12]方法并稍作調整。取MP 溶液2 mL，分別與2 mL 不同濃度的3 種蛋白酶抑制劑溶液充分混合。將混合物在55 ℃水浴鍋中分別孵育2、4 h，立即在冰水中冷卻，與1 mL 150 mg/mL 預冷的三氯乙酸（TCA）混合，在冰水中放置30 min，離心（10 000g，4 ℃，15 min）。上清液中的TCA 可溶性肽含量通過考馬斯亮藍法測定，抑制率（%）計算：

式中，ρI為含蛋白酶抑制劑的加熱樣品上清液中TCA 可溶性肽質量濃度（mg/mL）；ρC為不含蛋白酶抑制劑的加熱樣品上清液中TCA 可溶性肽質量濃度（mg/mL）；ρB為不含蛋白酶抑制劑的未加熱樣品上清液中TCA可溶性肽質量濃度（mg/mL）。

1.3.3 鱘魚內源絲氨酸蛋白酶粗酶制備 根據Cao等[13]方法并稍作修改，取魚肉，按質量（g）體積（mL）比1∶4 加入20 mmol/L Tri-HCl（pH 8.0），均漿1 min，在8 000g下離心20 min。取沉淀，按質量（g）體積（mL）比1∶4加入去離子水，均質，用1 mol/L HCl將均漿液pH調至6.0，離心，取沉淀，上述操作重復3次，以從MP中洗脫肌漿酶（收集洗脫4次的上清液，即為漂洗液）。按質量（g）體積（mL）比1∶4加入去離子水，均質，將勻漿液在沸水浴中加熱并攪拌，溫度達到55 ℃5 min 后迅速冷卻，離心，取最終的上清液并凍干。用去離子水溶解3 g凍干粉，定容至1 mL并均質，用1 mol/L HCl調pH至4.0。離心，取上清液，用1 mol/L NaOH調pH至7.0，得粗鱘魚內源絲氨酸蛋白酶。

1.3.4 絲氨酸蛋白酶活力測定 以1.3.3 中4 次漂洗液、粗酶液以及粗酶液與Pefabloc SC 混合樣品為樣，Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 為底物。在850 μL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，添加50 μL 樣品、100 μL 10 mmol/L底物，在55 ℃下反應20 min，加入1.5 mL 終止劑（甲醇、正丁醇、去離子水體積比為35∶30∶35）停止反應。用熒光分光光度計在380 nm激發波長和450 nm 發射波長下測量釋放的AMC熒光強度。酶活力定義為每min釋放0.1 nmol/L AMC的酶量為1單位（U）。

1.4 內源絲氨酸蛋白酶對MP凝膠的影響

1.4.1 MP 凝膠制備 1.3.1 中的均質、離心步驟重復3次，取最終沉淀，分為對照組（C）、額外添加蛋白酶組（H），各組蛋白調到80 mg/mL。C 組：將MP 放入廚師機中4檔空斬1 min，按質量分數2%加入NaCl，再擂潰9 min；H 組：在C 組的基礎上，加入鱘魚內源絲氨酸蛋白酶粗酶液[m(MP)/V(粗酶液)=450 g/1 mL]。取擂潰后的MP 于50 mL 離心管，于1 000g條件下離心5 min 以排出空氣。在正常二段加熱（40 ℃30 min+90 ℃20 min）模式上，增設劣化二段加熱模式（55 ℃30 min+90 ℃20 min）。各組命名為：CC，正常加熱模式對照組；HC，正常加熱模式額外添加酶組；CM，劣化加熱模式對照組；HM，劣化加熱模式額外添加酶組。熱處理后迅速冰水浴降溫，置于2 ℃下24 h 后，分初始階段、第1 段加熱結束、第2段加熱結束3個時間點測定以下指標。

1.4.2 對MP 凝膠裂解水平的影響 以TCA 可溶性肽含量表征MP裂解程度，參照Benjakul等[14]方法測定TCA 可溶性肽含量并稍作修改。取1.0 g 樣品，加入5 mL 質量分數10%三氯乙酸溶液，均質。于4 ℃、10 000g條件下離心10 min，取上清液，以考馬斯亮蘭法測蛋白濃度，結果表示為每克樣品的TCA可溶性肽質量（mg/g）。

1.4.3 對MP 凝膠化學作用力的影響 參照Pérez-Mateos等[15]方法測定MP凝膠化學作用力。準確稱取0.7 g 凝膠樣品，分別與7 mL 0.05 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaC1+8 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.05 mol/L β-巰基乙醇溶液混合（分別記為SA、SB、SC、SD、SE溶液），在10 000 r/min 條件下均質1 min，在4 ℃條件下反應1 h，在10 000g條件下離心15 min，取上清液，用雙縮脲法測定蛋白質濃度。化學作用力計算：

1.4.4 對MP 二級結構的影響 以傅里葉紅外光譜測定蛋白質二級結構，測定條件參考柴智等[16]，將溴化鉀研磨細后，于120 ℃下烘干24 h。取2 mg 肌原纖維蛋白凍干粉與200 mg溴化鉀，研磨混合，壓片。利用PeakFit 軟件（v4.12）處理1 600～1 700 cm-1的圖譜，根據各子峰積分面積及其對應關系計算蛋白質二級結構的相對含量（%）。

1.4.5 對MP 儲能模量的影響 通過流變特性實驗測定儲能模量（G＇），測定方法參照姜鵬飛等[17]并稍作修改。樣品蛋白質量濃度為80 mg/mL，夾具直徑為40 mm，平板間距1.0 mm，在夾具周圍滴加二甲基硅油。采用變溫掃描，正常二段加熱模式設置溫度從25 ℃升至40 ℃，在40 ℃保持30 min，再從40 ℃升至90 ℃，在90 ℃保持20 min；劣化二段加熱模式設置溫度從25 ℃升至55 ℃，在55 ℃保持30 min，再從55 ℃升至90 ℃，在90 ℃保持20 min。升溫速率均為1 ℃/min。

1.4.6 對凝膠微觀結構的影響 參考Zhou 等[18]方法并稍作修改，將凝膠（5 mm×5 mm×1 mm）在體積分數2.5%戊二醛中固定24 h，依次在體積分數為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脫水15 min。用100%乙醇脫水2 次，每次10 min。將樣品置于真空干燥器中干燥12 h。將干燥后的樣品噴金后，置于場發射掃描電子顯微鏡下觀察魚糜凝膠的微觀結構。

1.5 統計分析

用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析（ANOVA），通過Duncan法分析差異的顯著性，置信區間為95%（P＜0.05）。所有圖表均用GraphPad Prism 8軟件繪制。

2 結果與討論

2.1 引起鱘魚MP降解的主要蛋白酶分析

蛋白凝膠加熱時會經過凝膠化、凝膠劣化和魚糕化3 個過程，而引起凝膠性能下降的主要集中凝膠劣化階段（55～70 ℃）[19]。通過漂洗等手段可去除魚肉中大部分肌漿酶，降低肌漿蛋白酶對凝膠性能的影響，但即使經過6次漂洗，依然存在凝膠劣化現象[9]，引起凝膠劣化的原因可能與MP中結合的某種蛋白酶有關。

由表1 可見，各處理組中，低、高濃度的絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑Pefabloc SC 對鱘魚MP 在55 ℃降解的抑制率均高于其他3 類抑制劑，而金屬蛋白酶抑制劑EDTA 也有一定的抑制效果。依據Cao 等[20]的研究，魚類骨骼肌中存在肌原纖維蛋白MBSP，且活力最適溫度條件約為55 ℃，其活力可隨Ca2+或Mg2+的額外加入而提升，亦可因EDTA 加入而被部分抑制。因此，絲氨酸蛋白酶是引起鱘魚MP在55 ℃降解的主要作用酶。

表1 在不同濃度和加熱條件下不同類型蛋白酶抑制劑對粗酶的抑制率Table 1 Inhibition rate of different types of protease inhibitors on the crude enzyme derived from Sturgeon under different concentrations and heating conditions

2.2 絲氨酸蛋白酶活力分析

經過4 次漂洗，大部分肌漿絲氨酸蛋白酶已去除（表2）。經過加熱、離心、凍干等步驟，絲氨酸蛋白酶最終為肌原纖維蛋白MBSP，每mg蛋白的粗酶活力為0.012 U。將Pefabloc SC 加入粗酶中，加入0.4 mmol/L Pefabloc SC 的酶活力為0.000 14 U/mL，加入4 mmol/L Pefabloc SC的酶活力為0 U/mL。

表2 漂洗液中絲氨酸蛋白酶活力Table 2 Serine proteinase activity of liquid for bleaching

2.3 內源絲氨酸蛋白酶對鱘魚MP裂解水平的影響

TCA-可溶性肽含量是魚糜凝膠中小分子蛋白含量，反映蛋白質在內源性蛋白酶作用下的降解程度，與蛋白質降解程度呈正相關[21]。表3 是凝膠形成過程中，TCA-可溶性肽含量變化。在第1 段加熱過程中，HC組TCA-可溶性肽質量分數從1.26 mg/g增加到1.88 mg/g，而HM組則從1.26 mg/g 增加到3.15 mg/g，存在顯著差異（P ＜0.05），到第2 段加熱階段，HC組TCA-可溶性肽質量分數增加0.83 mg/g，而HM組則增加1.00 mg/g。相比對照組，額外添加內源絲氨酸蛋白酶組在正常加熱模式和劣化加熱模式下，隨著蛋白凝膠的形成，TCA-可溶性肽顯著上升（P ＜0.05），主要與額外添加MBSP降解MP有關。

表3 各組魚糜凝膠的三氯乙酸可溶性肽質量分數Table 3 TCA-soluble protein mass fraction of each surimi-gel group mg/g

2.4 內源絲氨酸蛋白酶對鱘魚MP化學作用力的影響

維持蛋白凝膠網絡結構的化學作用力主要為離子鍵、氫鍵、二硫鍵作用，疏水相互作用[22]，凝膠在加熱的過程中各化學作用力的變化，可能導致凝膠性能變化。圖1 是MP 凝膠加熱過程中離子鍵、氫鍵、二硫鍵作用及疏水相互作用的變化。

圖1(A)可見，初始階段，CC與CM組離子鍵為8.57 mg/mL，HC與HM組為10.74 mg/mL，表明離子鍵作用為維持蛋白結構的主要作用力，占比最大；至第1 段加熱結束，各組離子鍵比例迅速下降（P ＜0.05），這是因為隨著溫度的上升，疏水相互作用的增加，導致離子鍵斷裂[23]。

圖1(B)可見，與其他3 組氫鍵逐漸下降趨勢不同，HC組氫鍵初始為1.21 mg/mL，經過40 ℃加熱30 min后增加至3.91 mg/mL，差異顯著（P ＜0.05），第2段加熱結束后方降至0.49 mg/mL（P ＜0.05），可能與額外添加的粗酶有關，該條件的凝膠形成過程中，額外添加的粗酶阻止了蛋白質分子分散，氫鍵雖在蛋白質受熱變性時發生斷裂，但在魚糜凝膠冷卻后會重新形成[19]。

在凝膠加熱的過程中，疏水氨基酸的暴露導致疏水相互作用快速增加。圖1(C)表明，在第1 段加熱結束后，CC、CM、HM組疏水相互作用增加（P ＜0.05），而HC組疏水相互作用力從2.24 mg/mL 僅增至2.50 mg/mL，差異不顯著（P ＞0.05），這是由蛋白質內部的疏水基團未完全暴露出來所致；HM組雖同樣添加了額外的粗酶，但較高的溫度會導致更多的疏水基團暴露，疏水相互作用力從2.24 mg/mL 增至5.61 mg/mL，這也是與HC組存在顯著差異（P ＜0.05）的原因之一。由于MBSP 最適溫度在55～60 ℃，屬于耐熱型蛋白酶[8]，在此條件下，蛋白酶可降解部分蛋白，使更多的疏水性基團暴露出來，這也與表3結果相一致。

圖1 加熱過程中化學鍵含量變化Fig.1 Change of chemical bond content during heating

圖1(D)表明，各組在加熱過程中，隨著加熱溫度的提升，二硫鍵作用增加（P ＜0.05），但相同加熱模式的2 組之間差異不顯著（P ＞0.05）。這是因為二硫鍵作用為主要的共價作用力，主要與溫度有關[4]，更高的溫度促使二硫鍵的形成，而粗酶的添加對二硫鍵形成無顯著作用。

2.5 內源絲氨酸蛋白酶對鱘魚MP二級結構的影響

光譜中吸收最強的區域為酰胺I區（1 600～1 700 cm-1）[24]，這是蛋白質肽鍵的特征振動模式之一，可定量分析而獲得各種二級結構的相對含量。圖2可見，初始階段各組α-螺旋含量偏低，這是由添加NaCl和擂潰作用所致[4]，在加熱過程中，H組相比C 組的α-螺旋結構破壞更為明顯，HC、HM組α-螺旋比例分別從13.7% 降至10.7%，從13.7% 降至10.5%，而CM、CM組則分別從13.9%降至12.7%，從13.9%降至11.7%。凝膠形成的過程中，主要支撐天然蛋白質結構的α-螺旋結構遭到破壞，含量逐漸減少，這與袁凱等[25]研究結論相一致。

圖2 蛋白質二級結構變化Fig.2 Secondary structure changes of proteins

在第1 段加熱后，CM、HM組的β-折疊含量相比于CC、HC組增加更為明顯，但HC組在第一段加熱結束β-折疊含量從22.6%增加到27.7%，而CC組則是從21.2%增加到25.0%。說明溫度是β-折疊形成主要因素，較高的溫度會削弱氫鍵的相互作用，溫度導致蛋白質變性、α-螺旋結構解旋展開、β-折疊形成[26]，但內源絲氨酸蛋白酶會在一定程度上促進該過程。結合圖1 的結果，在第一段加熱結束后，HC、HM組維持凝膠結構的非共價鍵氫鍵存在顯著差異（P ＜0.05），HC組氫鍵顯著高于HM組，但氫鍵主要存在于β-折疊部分，其形成主要受溫度影響，HC組在該階段下β-折疊含量卻低于HM組。所以造成HC組第1加熱階段結束后，氫鍵增加、疏水相互作用未明顯增加的原因，更可能是在40 ℃下，由于額外添加內源絲氨酸蛋白酶降解了某些關鍵蛋白基團，阻止蛋白質分子內部的疏水基團暴露，且凝膠冷卻后重新形成氫鍵。而在第2 加熱階段，相比HC組，HM組的疏水相互作用顯著增加（P ＜0.05），這是因為在55 ℃條件下，高溫使蛋白質分子充分變性，大部分氫鍵遭到破壞，且在凝膠冷卻后不再重新生成，α-螺旋遭到破壞，疏水基團暴露，疏水相互作用相比正常加熱模式組顯著增加（P ＜0.05）。

2.6 內源絲氨酸蛋白酶對鱘魚MP儲能模量的影響

圖3(A、B)表明，隨著溫度從25 ℃上升到40 ℃，各組凝膠的G＇ 均迅速提高，在溫度40～55 ℃區間內急速下降，而HC、HM組在60 ℃后的升溫過程中，G＇升高趨勢均分別低于CC、CM組，這可能與在第1段恒溫加熱時期有關。經模擬凝膠二段式加熱過程，G＇從小到大依次為：HM（35 198 Pa）組、HC組（50 046 Pa）、CM組（65 100 Pa）、CC組（84 495 Pa）。圖3(C、D)表明，90 ℃恒溫加熱階段，HM組與HC的G＇相比于同種加熱模式下的CM組、CC組均增加緩慢。這是由于額外添加內源絲氨酸蛋白酶在40 ℃恒溫加熱的條件下可能使部分關鍵蛋白降解[5]，肌球蛋白頭部與部分螺旋形尾部結構相連的部分肽鏈解離不完全[27]，且包埋的疏水基團未能完全暴露，導致在后續的升溫過程中，蛋白質分子不夠分散，不能形成較好的凝膠網絡結構，G＇上升緩慢，降低了最終的凝膠流變性能。而在劣化加熱模式下，由于55 ℃加熱30 min 條件，使得MP 分子充分變性并伴隨著內源絲氨酸蛋白酶對蛋白質降解作用，使得H組與C組在55～75 ℃升溫區間內相比于正常加熱模式，G＇增加緩慢，甚至HM組在此溫度區間內G＇出現下降趨勢。

圖3 儲能模量（G＇）變化Fig.3 Change of the stored modulus(G＇)

2.7 內源絲氨酸蛋白酶對鱘魚MP 凝膠微觀結構的影響

圖4 表明，在正常加熱模式下，圖4(C)中孔徑比圖4(A)變大。這是由于MP 在加熱的過程中，初始時肌球蛋白頭部通過二硫鍵聚集，而在凝膠化的后續階段，則因肌球蛋白尾部的疏水相互作用而形成網狀結構，達到凝膠形成的目的[19]。相比劣化加熱模式，正常加熱模式凝膠分子團更大，且更為聚集。在兩種加熱模式下，蛋白酶粗酶的額外添加，均會導致凝膠結構更為松散，三維網絡結構松散。

圖4 凝膠微觀結構變化Fig.4 Microstructure of myofibrillar protein gels treated with different concentrations of endogenous serine protease

3 結論

鱘魚內源絲氨酸蛋白酶引起肌原纖維蛋白在55 ℃條件下降解的主要蛋白酶，金屬蛋白酶對蛋白降解也有一定作用。在肌原纖維蛋白凝膠形成的過程中，由于內源絲氨酸蛋白酶作用導致蛋白質降解。在凝膠化階段，伴隨疏水相互作用與氫鍵發生變化，蛋白質二級結構發生改變，使得此階段中儲能模量增幅緩慢，最終導致凝膠三維網絡結構疏松。