紅鰭笛鯛皮膚色素細(xì)胞組成、分布及類胡蘿卜素含量分析

許振民，陳子釗，崔海濤，王中鐸，郭昱嵩,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖重點實驗室/2.廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 湛江 524088）

體色是脊椎動物最具多態(tài)性的特征之一，是魚類適應(yīng)性進(jìn)化的重要表現(xiàn)。在消費市場上，魚類體色是魚身體健康的標(biāo)志和評判魚質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，多樣化的體色使得經(jīng)濟魚類的觀賞價值更高。魚類皮膚顏色主要源自黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞及一些復(fù)合色素細(xì)胞[1,2]。斑馬魚（Danio rerio，藍(lán)色和銀色）、鱖（Siniperca chuatsi，棕黃色）和豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus，黑色或紅色）等魚類色素細(xì)胞類型相同，但體色模式不一樣[3-5]。色素細(xì)胞發(fā)育受KIT（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Kit）、集落刺激因子、白細(xì)胞酪氨酸激酶和內(nèi)皮素等介導(dǎo)的多條信號通路調(diào)控，且神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)控制著體色的變化[6-11]。在物質(zhì)組成上，皮膚顏色依賴于色素細(xì)胞內(nèi)儲存的色素顆粒，紅/黃/橙色通常由蝶啶和類胡蘿卜素的積累所致，斑馬魚成魚黃橙色的依賴性物質(zhì)是類胡蘿卜素[12-14]。

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythropterus）隸屬鱸形目笛鯛科，廣泛分布于熱帶和亞熱帶的近岸和巖礁海區(qū)，是我國南海重要經(jīng)濟魚類，其成魚體色呈紅色或粉紅色，背部顏色較深，腹部顏色較淡，體表擁有過眼條紋和尾部黑斑（https://fishbase.org）。鮮紅的體色是紅鰭笛鯛的重要形態(tài)和經(jīng)濟特征。養(yǎng)殖魚由于缺乏膳食類胡蘿卜素來源，體色往往比野生魚暗淡，因此，通常在飼料中添加類胡蘿卜素以改善經(jīng)濟魚體色。如，蝦青素、角黃素、葉黃素和螺旋藻等類胡蘿卜素著色劑可增加大黃魚（Larimichthys crocea）、金赤鯛（Pagrus auratus）、大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）和雜交黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的組織類胡蘿卜含量和皮膚色度[15-20]，但未見紅鰭笛鯛的有關(guān)報道。

本研究擬評估紅鰭笛鯛不同部位皮膚顏色，結(jié)合石蠟切片、冰凍切片和電鏡切片揭示紅鰭笛鯛色素細(xì)胞形態(tài)、組成和分布規(guī)律，研究類胡蘿卜素與紅皮膚的呈色關(guān)系，為揭示紅鰭笛鯛紅體色形成機制和進(jìn)一步改善養(yǎng)殖魚體色提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用的紅鰭笛鯛為購自湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場的養(yǎng)殖魚。體長（30.70±2.94）cm，體質(zhì)量（680.82±168.45）g。

1.2 體色觀察

實驗魚經(jīng)MS-222 麻醉，拭干體表水分，用相機（Canon EOS 550D）拍 照，并用色差儀（3nh NR60CP）測定皮膚體色值，樣本數(shù)為19尾。測定部位，背鰭前緣下方、側(cè)線鱗上方皮膚，腹鰭至臀鰭間皮膚，尾柄處皮膚。測定前進(jìn)行色差儀白板校正，每個位置測定2 次，第2 次測量探頭旋轉(zhuǎn)180°，記錄體色值。

取相同大小的3 個部位皮膚，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，置于顯微鏡（Nikon ECLIPSE Ni-E）下觀察，隨機選取30 個視野統(tǒng)計色素細(xì)胞數(shù)量，計算平均單位面積下的黑色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞數(shù)量，用ImageJ v1.8進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 組織學(xué)觀察

對1.2 的皮膚組織進(jìn)行石蠟切片、冰凍切片和透射電鏡切片。石蠟切片用Bouin 氏固定液固定、HE 染色，切片厚度5 μm；冰凍切片組織置于-20 ℃恒溫下冰凍，經(jīng)蔗糖脫水和OCT（Optimal cutting temperature）包埋等步驟制成冰凍切片，切片厚度4～6 μm；透射電鏡切片組織經(jīng)固定、脫水、包埋和醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，使用電子顯微鏡（JEM-1400）觀察。

1.4 總類胡蘿卜素含量測定

總類胡蘿卜素含量（TCC）測定參考姚金明[20]方法進(jìn)行。分別準(zhǔn)確稱取皮膚、腸、肌肉、肝臟、視網(wǎng)膜和脾臟各0.1000 g，加入等質(zhì)量無水硫酸鈉和1 mL 丙酮，勻漿，補充丙酮至容積為10 mL，于4 ℃下避光孵育3 d。以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，以丙酮為空白對照，在473 nm 下測定各組織提取液的光密度值。TCC質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/g）計算：

式中，D為丙酮相在473 nm處的光密度值；K為常數(shù)（104）；V為提取液體積（mL）；E為摩爾消光系數(shù)，數(shù)值為2 500；G是樣品質(zhì)量（g）。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS/MS）測定皮膚類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素含量參考Krinsky等[21]和Geyer等[22]的方法以液相色譜和質(zhì)譜法測定。分別取1.2 中背部、腹部皮膚以及側(cè)線鱗下方（體側(cè)）皮膚，用研磨儀研磨（30 Hz，1 min）至粉末狀，稱取50 mg 研磨后粉末，用0.5 mL 含0.1 g/L 2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）的正己烷-丙酮-乙醇等體積混合液提取類胡蘿卜素，室溫下渦旋20 min，以4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，重復(fù)提取1 次，離心，合并上清液，將得到的提取液濃縮，用100 μL 體積比1∶1 的甲醇/甲基叔丁基醚混合液復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜后，保存于棕色進(jìn)樣瓶，由邁特維爾生物科技有限公司（武漢）進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0 軟件通過單因素方差分析比較體色值和總類胡蘿卜素含量數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果和分析

2.1 紅鰭笛鯛皮膚顏色差異

表1 顯示，腹部皮膚最亮（P＜0.05），背部皮膚最暗（偏黑）（P＜0.05），尾部皮膚最黃（P＜0.05），而尾部和腹部皮膚紅色值無顯著差異，且均顯著紅于背部皮膚。

表1 紅鰭笛鯛不同部位皮膚顏色值比較Table 1 Comparison of skin color values for different parts of Lutjanus erythropterus

不同部位皮膚的色素細(xì)胞數(shù)量結(jié)果（圖1）顯示，各部位皮膚紅色素細(xì)胞密度顯著高于黑色素細(xì)胞密度（P＜0.001），腹部皮膚中黑色素細(xì)胞數(shù)量稀少，甚至沒有。

圖1 紅鰭笛鯛不同部位皮膚黑色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞密度比較Fig.1 Comparison of chromatophore density in different parts of Lutjanus erythropterus

2.2 紅鰭笛鯛皮膚色素細(xì)胞的組織分布

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，背部皮膚和尾部皮膚均含有4 種色素細(xì)胞，即黑色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞交替分布，黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞位于下層；腹部皮膚主要包含紅色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，皮膚由表皮和真皮組成，表皮由5～8 層細(xì)胞組成，表皮中層含有較多顆粒細(xì)胞，表皮下層有1～2 層杯狀細(xì)胞，而色素細(xì)胞緊密排列在真皮層，并形成兩條連續(xù)的色素帶，分別位于表皮與鱗片之間和真皮致密層頂部。背部和尾部皮膚中均可見黑色素細(xì)胞。冰凍切片顯示了黃色素細(xì)胞的分布，虹彩細(xì)胞從背部向腹部呈增加趨勢。透射電鏡結(jié)果顯示，背部皮膚中含有較多黑色素顆粒，與類胡蘿卜素油滴和反射小板相間分布，尾部皮膚中反射小板緊密分布于黑色素顆粒和類胡蘿卜素油滴下方，腹部皮膚中分布著大量反射小板（圖2）。

圖2 紅鰭笛鯛皮膚形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察Fig.2 Morphological and histological characteristics in the skin of Lutjanus erythropterus

2.3 紅鰭笛鯛不同組織的類胡蘿卜素含量

圖3顯示，類胡蘿卜素在各組織中均有分布，但主要沉積在皮膚中，其次是視網(wǎng)膜。體側(cè)皮膚和背部皮膚中總類胡蘿卜素含量顯著高于其他部位皮膚（P ＜0.05）；尾部皮膚、腹部皮膚和視網(wǎng)膜中的含量顯著高于腸和肌肉（P ＜0.05）；腸、肝臟和脾臟中含量無顯著差異（P ＞0.05），肌肉中含量最低（P ＜0.05）（圖3）。

圖3 紅鰭笛鯛不同組織總類胡蘿卜素含量比較Fig.3 Comparison of total carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

液相色譜和質(zhì)譜結(jié)果表明紅鰭笛鯛皮膚含68種類胡蘿卜素中的16 種，其中，背部皮膚含13 種，體側(cè)皮膚11 種，腹部皮膚7 種。皮膚中類胡蘿卜素主要以類胡蘿卜素酯的形式存在，其中葉黃素酯最為豐富，但未檢出游離的葉黃素單體。黃色類胡蘿卜素包括葉黃素酯、玉米黃質(zhì)酯、紫黃質(zhì)酯，β-隱黃質(zhì)油酸酯和玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯。紅色類胡蘿卜素包括蝦青素、角黃素和β-檸烏素，其中蝦青素和角黃素2 種紅色類胡蘿卜素均存在于3 個部位皮膚，并呈線性數(shù)量差異（圖4）。

圖4 紅鰭笛鯛不同部位皮膚類胡蘿卜素含量比較Fig.4 Comparison of carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

3 討論

3.1 色素細(xì)胞和體色的關(guān)系

魚類豐富多彩的體色是由色素細(xì)胞間相互作用所致，受到色素細(xì)胞種類、數(shù)量和排布方式的影響。色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，并分布于皮膚真皮層，在鱖表皮中亦發(fā)現(xiàn)少量色素細(xì)胞。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的皮膚色素層依次為黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞和黑色素細(xì)胞，藍(lán)色條紋區(qū)域存在兩種排布方式的虹彩細(xì)胞[3]。鱖棕黃色皮膚的表層色素細(xì)胞為黃色素細(xì)胞，圖案區(qū)域含有大量連續(xù)分布的黑色素細(xì)胞[4]。豹紋鰓棘鱸皮膚中紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞均勻分布在真皮層，且紅色個體的紅色素細(xì)胞比黑色個體更多[5]。這說明表層色素細(xì)胞的分布特征對體色有重要的決定作用，皮膚圖案和呈色深淺受色素細(xì)胞數(shù)量的影響，即圖案區(qū)域和顏色較深的部位色素細(xì)胞數(shù)量越多，分布越密集。本研究中，紅鰭笛鯛皮膚的色素細(xì)胞分布在真皮層頂部，紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞交替分布在色素帶表層，紅色素細(xì)胞的數(shù)量優(yōu)勢使得紅鰭笛鯛呈現(xiàn)紅體色，這與豹紋鰓棘鱸體色變異個體中色素細(xì)胞的分布特征較為相似。然而，紅色度與紅色素細(xì)胞數(shù)量無明顯關(guān)系，主要受黑色素細(xì)胞分布情況的影響。水產(chǎn)動物的體色與色素細(xì)胞發(fā)育、分化及調(diào)控有關(guān)，不同發(fā)育階段的體色模式存在差異。紅鰭笛鯛在胚胎發(fā)育過程中已分化出黑色素細(xì)胞，黃色素細(xì)胞見于2日齡的仔魚，最早在鰓蓋上發(fā)現(xiàn)了虹彩細(xì)胞，在魚鰭上看見紅色素細(xì)胞[23,24]。因此，紅體色分布存在階段性，色素的沉積主要依賴于色素細(xì)胞的生長與發(fā)育情況。

3.2 類胡蘿卜素含量與體色的關(guān)系

紅色、黃色和橙色通常由類胡蘿卜素積累所致。類胡蘿卜素是由植物、一些細(xì)菌和真菌合成的脂溶性化合物，魚類只能通過攝食獲得。目前已發(fā)現(xiàn)天然類胡蘿卜素1 000多種，根據(jù)顏色可分為紅色類胡蘿卜素和黃色類胡蘿卜素，這些類胡蘿卜素的含量差異影響著水生動物的呈色[12]。魚類總類胡蘿卜素含量存在組織差異。大西洋鮭（Salmo salar）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等鮭科魚類的肌肉總類胡蘿卜素含量較高，而大黃魚主要沉積在皮膚中[19]。類胡蘿卜素對水生生物有調(diào)節(jié)生長、增強免疫力、抗氧化和改善視力等作用。葉黃素和玉米黃質(zhì)主要積累在眼睛黃斑中，可減免藍(lán)光和近紫外光對視網(wǎng)膜的損害，玉米黃質(zhì)可提高斑馬魚的視力[25]。葉黃素可改善日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）的生長性能和免疫活力[26]，提升金魚（Carassius auratus）幼魚的存活率以及改善黃顙魚的生長性能[17,27]。哺乳動物較易從食物中獲得類胡蘿卜素，而魚類會優(yōu)先使用葉黃素，滿足其對維生素A 的需求。維生素A 有維持眼睛正常視覺、上皮組織正常生長與分化，調(diào)節(jié)免疫和骨骼發(fā)育的作用[28]。攝食類胡蘿卜素還可提升魚類皮膚的色澤。Yi 等[16]研究表明，大黃魚皮膚的類胡蘿卜素含量、黃色度和紅色度與飼料中葉黃素和角黃素的比例呈線性相關(guān)，角黃素含量越高越利于皮膚發(fā)紅。角黃素和蝦青素均有增加紅劍魚（Xiphophorus helleri）紅色的作用，而蝦青素的增色效果更明顯[15]。本研究中，類胡蘿卜素主要沉積在紅鰭笛鯛視網(wǎng)膜和皮膚組織中，葉黃素和玉米黃質(zhì)等黃色類胡蘿卜素在皮膚中最為豐富，一方面可滿足皮膚組織細(xì)胞生長、免疫和抗氧化方面的需求，另一方面滿足了紅或黃色素細(xì)胞對黃色類胡蘿卜素的著色供應(yīng)。黃色類胡蘿卜素主要沉積在背部和體側(cè)皮膚中，而腹部皮膚同樣分布著紅色素細(xì)胞，類胡蘿卜素類型卻不一致，這進(jìn)一步說明紅色由紅色類胡蘿卜素提供。然而，蝦青素等紅色類胡蘿卜素所占比例極小。這可能意味著紅色呈色對紅色類胡蘿卜素的需求量不高，或是天然蝦青素多以蝦青素酯形式存在[29]。魚類除可將攝入的類胡蘿卜素直接用于體色呈色外，還可對攝入的類胡蘿卜素進(jìn)行分子修飾并產(chǎn)生新的衍生物類型。例如，鯉科魚類可通過氧化修飾作用將玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為蝦青素，但鮭魚不能通過代謝修飾合成蝦青素[30]。綜上，類胡蘿卜素是魚類呈色必不可少的物質(zhì)，蝦青素和角黃素可改善紅色經(jīng)濟魚類的體色，但紅色類胡蘿卜素在魚類體內(nèi)的代謝調(diào)控機制尚不清楚。

4 結(jié)論

紅色素細(xì)胞的數(shù)量優(yōu)勢及其在色素帶表層分布的特征是紅鰭笛鯛紅體色形成的重要原因。紅鰭笛鯛體內(nèi)的類胡蘿卜素主要沉積在皮膚和視網(wǎng)膜中，蝦青素和角黃素2 種紅色類胡蘿卜素與紅體色密切相關(guān)。本研究結(jié)果為紅鰭笛鯛養(yǎng)殖魚體色的改善研究提供參考，可進(jìn)一步在飼料中補充蝦青素和角黃素以提升紅色。