新型糖尿病治療藥物西他列汀制備技術研究進展

章鵬鵬，孟凡婷，牛婷婷，王 普

（浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014）

新型糖尿病治療藥物西他列汀制備技術研究進展

章鵬鵬，孟凡婷，牛婷婷，王 普*

（浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014）

西他列汀是首個二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑的II型糖尿病治療藥，該藥物的制備技術主要經歷了三代工藝路線的發展。本文主要綜述了西他列汀的制備技術，以及生物催化法應用于西他列汀的合成工藝路線，并對今后西他列汀制備技術的發展方向進行了展望。

西他列汀；II型糖尿病；生物催化法

0 引言

近年來，糖尿病發病率逐年提高。糖尿病已成為繼心血管類疾病、惡性腫瘤后又一嚴重威脅人類健康的非傳染性疾病。而糖尿病的II型發病率占90%。II型糖尿病的發病機制主要是因為人機體對胰島素的抗性和胰島素β細胞的功能缺陷所引發的[1]。臨床上用于II型糖尿病治療藥主要有胰島素分泌促進劑 （磺酰脲類、氯茴苯酸類）、胰島素增敏劑（雙胍類、噻唑烷二酮類）、胰島素及胰島素受體激動劑和二肽基肽酶-4 （DPP-4）抑制劑。

西他列汀 （Sitagliptin，JanuviaR），化學名稱為：（3R）-3-氨基-1-[3-（三氟甲基）-5，6，7，8-四氫-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪-7-基]-4-（2，4，5-三氟苯基）丁-1-酮，英文名稱為（3R）-3-Amino-1-[3-（trifluoromethyl） -5，6，7，8-tetrahydro-1，2，4-triazolo[4，3-a]pyrazin-7-yl]-4-（2，4，5-trifluorophenyl）butan-1-one， 它是由 Merck Sharp&Dohme Ltd公司開發的首個二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑，是II型糖尿病口服治療藥捷諾維（鹽酸西他列汀片，JANUVIA）的活性成分，該藥在2006年10月于美國上市。西他列汀是一種二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑，通過酰胺部分與DPP-4活性部分結合（結合模式圖見圖1），抑制其活性延長降血糖素（Incretin）[2]的半衰期，使得血漿中GLP-1和GIP活性提高的同時只是輕度增加其含量，卻不會引起因GLP-1含量過高而產生的副作用，具有較好的安全性和耐受性[3-5]。在聯合用藥方面，與二甲雙胍[6]或吡格列酮[7]聯合用藥時均優于其各自單獨用藥。臨床上對于西他列汀的應用相比于同類藥物其用藥優勢突出，基于其良好的市場前景，西他列汀具有較好的研究價值。近年來，對于西他列汀用藥的需求增加，西他列汀的制備技術受到廣泛關注。本文主要綜述了西他列汀的三代制備工藝路線的發展，并介紹了生物催化法應用于合成西他列汀的制備工藝。

1 西他列汀的三代制備工藝路線

西他列汀在工業化生產前在實驗室研究階段的合成路線，以及工業化生產的第一代和第二代的合成工藝路線合成過程每一步都經過化學合成而成。第三代工藝路線中將生物催化法應用于合成路線，使得西他列汀的產率和e.e.值都有明顯的提高。

圖1 西他列汀與DPP-IV活性部位結合Figure 1 Mechanism of Sitagliptin involving the active site of DPP-IV

1.1 西他列汀處于實驗室研究階段的制備工藝由Kim等[5]發表的處于實驗室研究階段的合成路線較為繁瑣，所需的反應條件苛刻，需要低溫及較長反應時間，反應路線中部分使用的試劑也較昂貴，因此該反應路線并沒有用于實際的工業化的生產。

1.2 西他列汀第一代制備工藝的合成路線

用于西他列汀工業化生產的第一代合成路線是由Hansen等人[8]采用手性磷根釕催化劑催化合成的化學合成路線。其路線圖如圖2所示，該反應路線是由 4-（2，4，5-三氟苯基）-3-氧代丁酸甲酯（1）經手性金屬催化劑（S）-聯萘二苯膦-氯化釕[（S）-binap-RuCl2]催化不對稱加氫后，于氫氧化鈉的甲醇溶液中水解，得水解產物（2），（2）在N-乙基-N-二甲胺基丙胺碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl）作用下，與O-芐基羥胺經縮合后，在三苯基膦和偶氮二甲酸二異丙酯（DIAD）的作用下環合得到 β-內酰胺類化合物（3），（3）經氫氧化鋰水溶液水解開環得（4），（4）與 3-（三氟甲基）-l，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪（5）縮合后、脫去保護基團，即得西他列汀。

圖2 第一代合成路線Fig 2 1st Generation process

1.3 西他列汀第二代制備工藝的合成路線

西他列汀的第二代合成路線[9]是由美國默沙東公司開發的采用手性銠作催化劑構建手性中心的化學合成路線，該路線較之前降低了生產成本； 以 2，4，5-三氟苯乙酸 （7） 與 2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮 （8）縮合后生成化合物（9），（9）與 3-（三氟甲基）-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪（5）縮合后得到（2Z）-4-氧代-4-[3-（三氟甲基）-5，6-二氫-[1，2，4] 三唑并 [4，3-a] 吡嗪-7-（8H）-基]-1-（2， 4，5-三氟苯基） 丁-2-酮（10），（10）與乙酸銨作用得烯胺，烯胺在二聚氯代（l，5-環辛二烯）銠[{Rh（cod）Cl}2]和（R）-（-）-[（S）-2-[二（4-三氟甲基苯基）膦]二茂鐵基乙基-2-叔丁基膦（R，S-t-bujosiphos）的作用下發生不對稱加氫反應，得到西他列汀。

1.4 第三代合成路線

西他列汀的第三代合成路線[10]是在第二代化學合成法的基礎上，改進了工藝，利用了突變轉氨酶構建手性中心的方法開發了綠色環保的新型生物催化合成路線。將西他列汀中間體（2Z）-4-氧代-4-[3-（三氟甲基）-5，6-二氫-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7-（8H）-基]-1-（2，4，5-三氟苯基）丁-2-酮（10），通過突變轉氨酶ATA117的轉氨基作用，直接將（10）合成為西他列汀。將轉氨酶法運用于第三代合成路線，其產率較第二代的合成路線提高了53%，e.e.值也提高至99.95%，同時廢物的排放也減少了19%。

圖3 第二代和第三代合成工藝路線Fig 3 2nd Generation process and 3rd generation process

2 生物催化法在西他列汀制備工藝中的應用

2.1 轉氨酶法

轉氨酶（aminotransferases，EC 2.6.1.X），屬于轉移酶類，是以輔因子磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）為氨基轉移媒介，通過可立體選擇性催化氨基供體（氨基酸或簡單胺類）的氨基轉移到潛手性受體酮來獲得目的產物。轉氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇的制備及重氫手性標記。

在三代的合成路線中，Savile等[10]利用生物催化法通過突變轉氨酶構建手性中心，從而使得合成工藝得到大幅度的優化。其過程是采用計算機分子模擬技術研究底物與酶的分子識別機理，發現西他列汀前體酮對應的兩個大口袋酶結合位點是實現立體識別并完成反應的關鍵。利用計算機輔助設計和蛋白質工程技術，在野生型ω-轉氨酶的基礎上對其進行定向改造，經由底物結構的理性化設計和同源酶模型ATA-117的迭代突變重組，先后對酶的兩個大口袋位點進行組合突變定向改造，經11輪定向進化后篩選獲得27位點突變的新酶氨基酸序列。重組酶易于表達，結構穩定性和熱穩定性均良好，能以廉價的異丙胺為氨基供體，耐受高濃度的DMSO（底物助溶劑），催化效率高。當酶添加量為6 g/L，24 h可實現200 g/L底物完全轉化，e.e.值＞99.5%。但是該轉氨酶生物催化劑開發改造過程難度大，突變篩選通量大，改造風險和投入成本高。

2.2 間接合成，羰基還原酶法合成關鍵手性中間體

Cardila Healthcare Limited公司設計了手性胺的間接合成路線（見圖4），同樣以西他列汀前體酮化合物OTPP為底物，利用重組羰基還原酶催化不對稱還原合成中間體（S）-HTPP而獲得手性中心，再分別與甲磺酰氯、疊氮化鈉反應替換該手性中心的羥基后，與Pd/c和硼氫化鈉反應即可獲得西他列汀[11]。

圖4 手性胺的間接合成路線Fig 4 Indirect synthesis of chiral amines

以全細胞為催化劑不對稱還原前體酮制備手性醇研究已經十分成熟，且將羰基還原酶法運用于該合成路線具備工藝的可行性，相關工藝也易于開發。故通過生物法不對稱還原前體酮化合物OTPP制備該手性醇中間體（S）-HTPP（如圖5）的研究便有著重要的意義。目前所報道的有Biocon Limited公司[12]利用真菌微生物短密青霉（Penicillium brevicompactum）MTCC 5962催化OTPP進行生物催化還原。

圖5 全細胞催化OTPP制備手性醇中間體（S）-HTPPFig 5 Preparation of chiral alcohol intermediates（S） -HTPP by whole cell catalysis

針對相同的還原底物，筆者所在課題組[13]自行篩選得到了具有高立體選擇性制備西他列汀關鍵手性中間體（S）-HTPP的菌種——小孢根霉須狀變種 （Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis）ZJPH1308。當底物濃度為 1~10 mmol/L時，反應產率達95%以上，提高底物濃度至15 mmol/L時，產率最高為85%；至20 mmol/L時，產率最高達到72%。而其e.e.值都保持＞99%。另外，本課題組還從土壤中篩選得到一株惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）YHB3-10也可用于催化相同的反應，當底物濃度為10mmol/L時，反應24 h后產率為91.49%。當底物濃度提高至22.5mmol/L，并且在反應介質體系中加入5%（v/v）的鄰苯二甲酸二丁酯，產率可達75.61%，較未添加的對照提高了 31.7%，e.e.值＞99%[14]。

Xia等[15]利用篩選得到的假單胞菌（Pseudomonas Pseudoalcaligenes）靜息細胞在DMSO溶劑中不對稱還原OTPP合成（S）-HTPP，并且菌體細胞可實現重復批次利用。當底物濃度為25 mmol/L時，產率達90%以上，e.e.值＞99%。

3 結論與展望

近年來，人們在物質生活水平快速提升的同時，II糖尿病的發病率也逐年提高，對人類的健康問題的威脅也在逐漸增大。西他列汀是目前II糖尿病的首選治療藥，有著較好的市場前景，其開發上市和制備技術的發展受到廣泛的關注。目前對于西他列汀的制備技術雖然已較為成熟但仍存在不足，所以對于西他列汀的制備技術的開發仍值得研究。生物催化法在化合物合成上因其能避免一些化學法所必須的苛刻條件等優勢，因此得到了廣泛的應用。如何更好地將生物法運用于西他列汀制備的工藝路線中是未來研究的方向。

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Abstract：Sitagliptin is the firstdipeptidylpeptidase-4 （DPP-4） inhibitor type IIdiabetesdrug.The developmentof this drug after themarkethas gone through three generations of the development process line.In this paper,the preparation technology of sitagliptin and the biocatalytic method applied in the synthesis of sitagliptin weremainly introduced.The future development of sitagliptin preparation technology was also discussed.

Keywords：Sitagliptin；type 2 diabetes；biocatalysis

Research Progress in Preparation Technique of Type 2 Diabetes Drug Sitagliptin

ZHANG Peng-peng，MENG Fan-ting，NIU Ting-ting，WANG Pu*
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China）

1006-4184（2017）9-0015-05

2017-02-22

浙江省自然科學基金項目（LY16B060010）；國家自然科學基金項目(21676250)資助。

章鵬鵬(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：生物催化與手性合成。

*通訊作者：王普，女，教授，博士生導師。E-mail:wangpu@zjut.edu.cn