不同栽培品種（系）橄欖香氣成分特征及差異研究

摘要：【目的】探究不同栽培品種（系）橄欖果實香氣成分特征及差異，為橄欖的果實香氣品質和品種選育提供參考。【方法】以11 個不同品種（系）橄欖為試驗材料，采用電子鼻結合頂空固相微萃?。℉S-SPME-GC-MS）技術，對不同品種（系）橄欖香氣成分進行分析?！窘Y果】電子鼻實驗可以將11 個品種（系）橄欖進行區分，說明參試11 個品種（系）橄欖香氣特征存在差異。HS-SPME-GC-MS實驗結果表明，11 個不同品種（系）橄欖共檢測出57 個揮發性物質成分，其中有23 個揮發性物質是不同品種（系）橄欖主要差異物質。結合香氣活性值（odor activity value，OAV）分析結果進一步篩選出α-蒎烯、石竹烯、α-石竹烯等香氣物質，這些化合物可能是構成橄欖果實香氣特征差異的主要香氣活性物質；可以將不同橄欖產區11 個橄欖品種（系）分為兩類，即以平陽1 號、平陽3 號等為代表的木香型品種（系），以梅埔2 號、劉族本等為代表的清香型品種（系）?！窘Y論】烯萜類化合物為橄欖主要香氣物質，11 個不同品種（系）橄欖香氣成分與含量均存在差異，經過OAV分析，α-蒎烯和石竹烯等為主要特征香氣活性物質。

關鍵詞：橄欖；香氣；電子鼻；頂空固相微萃?。幌銡饣钚灾?/p>

中圖分類號：S667.5 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1640-11

橄欖（Canarium album）是我國特有的亞熱帶果樹[1-2]，常種植于我國的福建、廣東、浙江等地。其中福建福州地區栽培的品種有靈峰、檀香、清欖1號等，莆田地區栽培的品種有霞溪本和劉族本等；廣東揭西地區栽培的品種有三棱欖和揭西香欖等；浙江溫州蒼南一帶還栽培平陽1 號、平陽2 號等。香氣是客觀反映果實風味、成熟度和果實品質的重要指標，果品怡人的香氣也是吸引消費者和增強市場競爭力的重要因素。隨著國內外市場對果品品質要求越來越高，以及食品工業對天然風味物質需求的增加，果品的香氣研究日益受到關注，已成為果品品質的重要研究領域之一[3-4]，因此對不同品種橄欖香氣品質差異的研究具有一定的意義和價值。

電子鼻是一種快速無損檢測的新型人工智能嗅覺裝置，在食品方面的應用非常廣，涉及食品分類、風味研究、新鮮度評價、保質期評價等主要領域[5]，其缺點是不能準確定量樣品中每一種具體揮發性物質[6]。果實香氣富集方法包括同時蒸餾萃取法（SED）[7]、固相微萃取法（SPME）[8]等。頂空固相微萃取法作為一種氣相色譜的無溶劑萃取技術，具有操作簡單、富集率高、重現性好等優點，也可以更加準確、真實地反映香氣成分的組成狀況[9-10]，與電子鼻結合可以取長補短、發揮兩種儀器的優勢。鐘明等[11-12]采用固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用方法對廣東的冬節圓和三棱欖果實揮發油化學成分進行分析，結果顯示2 個品種（系）中的香氣成分主要有石竹烯、大根香葉烯D、α-古巴烯、α-蒎烯和檜烯等；趙麗娟等[13]采用同時蒸餾萃取裝置，并用GC-MS分別對橄欖中的橄欖肉和橄欖仁的揮發油進行提取和鑒定，得出石竹烯、丁二酸二丁酯、十五烷、環己酮等為主要香氣成分；方麗娜等[14]對長營果實的香氣進行檢測分析，鑒定出大量的石竹烯和古巴烯等；賴瑞聯等[15]采用頂空固相微萃取法對福州3 個鮮食橄欖品種（系）進行檢測，研究結果表明，石竹烯是橄欖果實香氣物質中含量較高且穩定的物質，烯烴類物質占大多數。上述關于橄欖果實香氣成分的研究僅集中于福州、廣東等單一地區的橄欖品種（系），前人結果表明不同產地的橄欖品種（系）香氣組分存在差異，但并未對不同產區的品種（系）進一步進行分析，探究其香氣特征是否存在差異。

筆者課題組前期利用HS-SPME-GC-MS進行研究，表明不同橄欖品種（系）在香氣物質組分與含量間均存在差異[16]，筆者在此基礎上進一步優化了頂空萃取方法并結合電子鼻技術對11 個不同品種（系）橄欖香氣物質進行檢測，探究3 個主要栽培區域不同品種（系）橄欖的香氣特征與香氣組分差異。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

于2020 年10—12 月采集福州市農業科學研究所、閩侯、閩清、莆田等地11 個不同品種（系）橄欖果實，分別為福建區域主要栽培品種靈峰、檀香、梅埔2 號、清欖1 號、霞溪本、劉族本，廣東區域主要栽培品種揭西香欖、三棱欖，浙江區域主要栽培品種平陽1號、平陽2號和平陽3號。每個品種選擇長勢一致、無病蟲害的果樹。采果時沿樹冠東西南北方位取大小適中、均勻一致，無病蟲、無損傷且成熟度為九成熟的果實，每個品種設3 次重復，每個品種1 次共取30個果實。取回實驗室后清洗、削皮混樣處理之后將果皮用錫箔紙包裹，用液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 電子鼻測定取出樣品放入液氮盒中，用多樣品組織研磨儀（60 Hz，60 s）將樣品磨成粉末。取1 g 磨好的樣品于60 mL頂空瓶中，于50 ℃在水浴鍋內平衡5 min 后開始檢測。利用iNose 型電子鼻，參照前人實驗參數并加以優化[17-19]，設置氣體流量為0.60 L·min-1；采樣時間為300 s；進樣準備等待時間為10 s；樣品清洗時間為120 s；操作環境溫度50 ℃。

1.2.2 氣相色譜-質譜（GC-MS）測定樣品前處理。取出樣品放入液氮盒中，用磨樣機（60 Hz，60 s）磨成粉末。取1 g 磨好的樣品放入頂空萃取瓶中，加入1 mL飽和氯化鈉溶液和6 μL（100 μg·mL-1）癸酸乙酯內標溶液于頂空瓶中，再將瓶口密閉，隨后在50 ℃磁力攪拌加熱器中預熱8 min。

頂空固相微萃取（HS-SPME）條件參考筆者課題組前期方法[16]并加以優化。使用萃取纖維頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取頭在250 ℃條件溫度下老化60 min 后，將萃取針插入存放樣品的頂空瓶中，設置萃取溫度50 ℃，頂空萃取45 min，并在250 ℃下解析4 min，進行GC-MS分離鑒定。測定方法：利用GC-MS 氣質聯用儀（型號：GC680 +SQ8T+HS40），參照方麗娜等[14]的GC-MS方法并加以優化，對不同品種（系）的橄欖進行香氣測定。色譜條件：FFAP-5MS；載氣為99.99%氦氣，壓力100 kPa；分流比10∶1；柱箱溫度50 ℃，進樣口溫度250 ℃，柱流量1 mL·min-1；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min；以5 ℃ · min- 1 升至150 ℃ ，保持5 min；以10 ℃·min-1 升至230 ℃，保持5 min。質譜條件：電子轟擊離子源；接口溫度250 ℃ ；離子源溫度300 ℃；質量掃描范圍50～620 m/z。

1.3 數據分析

在GC-MS 條件下，測得橄欖揮發性成分GCMS總離子流色譜圖。根據質譜圖NIST 11.L 與質譜庫Wiley 7 確定揮發性物質成分，并參照每種香氣成分的CAS編號，同時結合人工譜圖解析和資料分析進行定性。定量通過與內標物的峰面積比較，得到揮發性物質成分的含量（w），單位為μg·g-1，即：揮發性物質成分含量=（揮發性物質成分物質峰面積×內標物含量）/內標物峰面積。通過查閱文獻報道的香氣組分在水介質中的氣味閾值，再通過香氣組分在橄欖中的相對含量，計算得到部分香氣組分在橄欖果實中的OAV（即揮發性物質成分的相對含量與香氣成分閾值之比）。使用Origin2018 軟件繪制指紋圖譜；使用TBtools 繪制熱圖；利用https：//cloud.metware.cn 網站進行PCA 和OPLS-DA，計算預測變量重要性投影（variable importancein projection，VIP）；并結合SPSS 19.0 軟件進行單因素分析。以p＜0.05、VIP≥1 為條件篩選差異揮發性物質成分；利用主成分分析（principalcomponent analysis，PCA）對結果進行提取和可視化作圖。

2 結果與分析

2.1 基于電子鼻技術的不同品種橄欖香氣差異分析

通過對11 個不同品種（系）橄欖電子鼻數據進行OPLS-DA分析（圖1-A），11 個不同品種（系）橄欖在得分散點圖的橫軸上實現了區分；模型交叉驗證結果（圖1-B）顯示，自變量擬合指數（R2X）為0.818，因變量擬合指數（R2Y）為0.733，模型預測指數（Q2）為0.597。其中福州地區主要栽培的品種（系）模型比較接近，廣東地區主栽的揭西香欖與三棱欖有一定的相似性，浙江地區的平陽欖與其他品種（系）相比能較好區分，說明不同品種（系）橄欖香氣存在一定區別。

從電子鼻檢測數據繪制的電子鼻特征氣味雷達圖（圖1-C）可看出，10 個傳感器對揮發性成分的響應值不同。在10 個傳感器中，S2 響應值在1.95～4.43 之間，認為該傳感器是橄欖特征香氣最敏感的傳感器。如表1 所示，S1、S7 和S8 這3 個傳感器對不同品種（系）橄欖起到區分作用（VIP＞1，p＜0.05），這些傳感器可能在本試驗OPLS-DA判別模型中的貢獻較大，其他傳感器響應并不顯著。

2.2 不同品種（系）橄欖揮發物成分特征分析

2.2.1 基于不同品種（系）橄欖揮發物成分分析為研究不同品種（系）橄欖果實的香氣特征，利用頂空固相微萃取與氣相色譜質譜聯用的方法對11 個橄欖品種（系）的揮發性物質成分及相對含量進行分析鑒定。試驗品種（系）共檢測到57 種，其中包括33 種烯烴類、4 種苯環類、3 種醛類、1 種酚類、1種醚類、4 種醇類、4 種萘類、2 種酮類、5 種烷烴類。以檢測出的57 個揮發物組分作為因變量，不同品種（系）作為自變量，通過OPLS-DA分析，可以實現不同品種（系）橄欖樣品的有效區分（圖2-A）。從圖2-B可知，自變量擬合指數（R2X）為0.505，因變量擬合指數（R2Y）為0.994，模型預測指數（Q2）為0.985，表示模型擬合結果可接受，說明模型不存在過擬合，模型驗證有效，認為該結果可用于不同橄欖品種（系）鑒別分析。

根據這些揮發物成分的峰保留時間、峰面積值等相關參數建立不同品種（系）橄欖揮發物指紋圖譜，如圖2-C所示，不同地區樣品揮發物指紋圖譜之間具有一定的差異。

為了獲得更準確和更直觀的聚類結果，使用主成分分析對揮發物組分數據進行降維處理，得到11個不同品種（系）橄欖的得分散點3D圖（圖3-A），樣本間的相似度越高則距離越近。圖3-B為主成分分析可解釋變異圖，左圖為累計可解釋變異，縱坐標代表各個主成分的累計貢獻值，累計比值越接近于1，表示PCA模型的可靠性越強；右圖為各個主成分的可解釋變異，可看出PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，其累計方差貢獻率分別為27.08%、20.83%、13.20%、10.77%、7.04%，其中PC1、PC2 和PC3 的方差貢獻率之和為61.1%，具有較高的可靠性。α-蒎烯、石竹烯、α-石竹烯等揮發性物質是構成主成分得分圖的主要貢獻物質。

2.2.2 不同品種（系）橄欖揮發物成分的聚類分析基于不同品種（系）橄欖揮發物成分繪制聚類熱圖（圖4），不同品種（系）橄欖樣品揮發物組分和含量豐富，在組成種類、含量、占有比例、特有成分等方面均存在較大差異。聚類熱圖結果顯示，可以將11 個不同品種（系）橄欖分為兩大類，以平陽1 號、清欖1號等為代表的一類品種（系），其主要揮發物含量高于梅埔2 號、劉族本等品種（系）。其中平陽1 號和平陽2 號的揮發物成分有一定的相似性且顯著區別于其他品種（系），這兩個品種（系）的揮發物總含量高于其他品種（系），以石竹烯、α-蒎烯等物質最為顯著。參試的劉族本、平陽2 號揮發物物質總含量相對較低，各主要揮發物成分物質含量均不顯著。上述11 個不同品種（系）橄欖揮發物成分中烯烴類化合物是構成橄欖果實香氣特征的主要物質，但在不同品種（系）橄欖中，揮發物組成成分、各物質含量占有比例及特有成分等方面都存在差異。結果可為后續橄欖果實香氣物質代謝途徑及代謝物相關基因的挖掘與功能分析提供參考。

2.3 不同品種（系）橄欖揮發物差異分析

2.3.1 不同品種（系）橄欖揮發物成分差異分析進一步分析不同揮發物成分對區分橄欖品種（系）的貢獻率，根據p＜0.05、VIP≥1 的標準，篩選出23 種不同品種（系）的差異揮發物物質（圖5），其中烯烴類物質16 種、萘類3 種、苯環類2 種、酚類1 種、醇類1種。如圖5所示，靈峰差異化合物主要為去氫白菖烯、檜烯、D-檸檬烯等；清欖1號中以α-蒎烯、γ-欖香烯、鄰異丙基甲苯等為主要差異化合物；揭西香欖中以大根香葉烯D、莰烯、（1S，8aR）-1-異丙基-4，7-二甲基-1，2，3，5，6，8a-六氫萘等為主要差異化合物；平陽1號和平陽3 號中以（-）-α-蓽澄茄油烯、百里香酚、α-蒎烯等為主要差異化合物。上述各樣品中的差異化合物對構成不同品種間風味品質的差異有一定的影響。

2.3.2 不同品種（系）橄欖香氣OAV分析前人研究通過計算OAV值來評價單個香氣對果實整體香氣的貢獻度，OAV值＞1 時認為該揮發物組分對果實香氣具有一定的影響，OAV值＞10 時認為該揮發物組分對果實整體香氣貢獻極大。結合文獻報道的香氣成分的閾值和屬性描述，計算11 個不同品種（系）橄欖香氣成分的OAV值。由表2 可知，共有19種香氣成分可計算OAV，且大多數OAV 值均大于1，認為這些香氣物質可能對區分不同品種（系）橄欖果實的香氣特征具有重要作用?；诓煌贩N（系）橄欖OAV數據繪制聚類熱圖（圖6），可以將11 個品種（系）大致分為兩大類。

3 討論

在以往的研究中，廣東品種（系）三棱欖[11]和冬節圓橄欖[12]中含量較高的香氣成分主要有石竹烯、大根香葉烯D、α-古巴烯、α-蒎烯和檜烯等，福州地區栽培的長營[14]、清欖1 號、靈峰[15]等也包含有大量的石竹烯和古巴烯等，本試驗結果與前人相似，通常認為，大部分具有揮發性的物質并無氣味，不能構成果實的特征香氣，只有香氣活性組分才對香氣具有顯著貢獻[25]，因此香氣成分含量并不能夠作為判定果實香氣特征的主要依據，通常賦予果實香氣特征的是具有較高OAV值的香氣成分[26-27]。認為單個香氣成分對果實整體香氣的貢獻取決于濃度和氣味閾值[20]。各個品種（系）中α-蒎烯的OAV值均大于1，并且大多數品種（系）OAV值大于100，因此α-蒎烯是橄欖果實中重要的香氣特征物質。在特殊香氣分類方面，果實香氣類型通?？煞譃楣阈?、木香型和醛香型等幾種，周如雋等[28]、張海朋[29]等將蒎烯類揮發性物質香氣描述為清新清香、木香、甜香型，α-蒎烯是本研究中OAV值最高的，即香氣貢獻程度最高的揮發性物質，因此橄欖果實烯烴類香氣主要成分所表現出來香氣風味為木香、甜香型。石竹烯作為橄欖香氣組分中含量最高且穩定存在的物質，其OAV 值在各個品種（系）中均大于1，有6 個品種（系）中的OAV值＞10，認為石竹烯對橄欖果實整體的香氣有較大的貢獻。

前人從香氣物質含量方面對橄欖的品種（系）進行分類的研究報道較少。本研究在分析OAV值的基礎上將11 個不同品種（系）橄欖分為2 類，分別為木香型與清香型，其中平陽1 號、平陽2 號，靈峰、清欖1 號等由于α-蒎烯、石竹烯和β-蒎烯等的OAV值顯著高于其他品種（系）表現出顯著的松油香、木香，月桂烯、D-檸檬烯與反式-2-己烯醛[30-31]等能表現出果香、清香及檸檬香，但香氣活性值與α-蒎烯等相比差異顯著，認為該類品種（系）為木香型；此外本研究中的平陽1 號與平陽3 號，香氣組分的含量顯著高于其他品種（系），因此表現出來的香氣特征也會高于其他品種（系），與電子鼻實驗得到的結果相同，并且OAV值較其他品種（系）也有顯著的差異，因此參試的平陽1 號、平陽3 號是最具橄欖果實香氣特征的品種（系），認為α-蒎烯、石竹烯、β-蒎烯等可能是形成橄欖香氣特征的關鍵香氣化合物。檀香、三棱欖、梅埔2 號等品種（系）表現出的松油香、木香相對不顯著，由于這類品種（系）總體的香氣活性值均不顯著，且反式-2-己烯醛與月桂烯在這類品種（系）香氣組分中占比較高，即更多地呈現出一定的清香與果香，因此這類品種（系）呈現的香氣類型為清香型。橄欖果實中主要香氣成分烯烴類物質所表現出來香氣風味為木香、甜香型，可能是橄欖鮮食入口初苦澀后呈回甘清甜感官效果的因素[32]。

筆者在本研究中對影響不同品種（系）橄欖果實的香氣成分進行分析比較，為辨別不同橄欖品種（系）提供理論參考。此外，同一品種（系）受不同產地土壤、小氣候影響可能會對香氣品質造成一定的影響，因此后續可以進一步研究不同產地相同品種（系）的橄欖果實，還需進一步控制變量，結合飛行時間氣相質譜、礦物質元素和氣相色譜離子遷移譜等技術，為福建、廣東、浙江等地橄欖果實的香氣品質研究提供參考。果實揮發性成分與成熟過程中的植物生理代謝機制緊密相關[33]，后續還應對橄欖萜烯類化合物代謝途徑中相關的基因進行挖掘與功能驗證，探究形成其風味特征的機制。

4 結論

不同橄欖品系的香氣成分差異較大，這些品種（系）的重要香氣成分都是以烯萜類物質為主，因此該類物質構成了橄欖的香氣特征骨架。通過聚類和OAV分析，將參試橄欖香氣特征分為清香型與木香型，α-蒎烯和石竹烯等為主要特征香氣活性物質。

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