鐵皮石斛分子生物學(xué)研究進(jìn)展

摘要：鐵皮石斛在“九大仙草”中名列魁首，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗風(fēng)濕、降血糖血脂等功效，其分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究受到了廣泛關(guān)注。開展對鐵皮石斛的研究，不僅具有重要的科學(xué)意義，還具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價值。本文從鐵皮石斛基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆與功能、轉(zhuǎn)基因研究等方面對鐵皮石斛的分子生物學(xué)研究進(jìn)行綜述，為加快分子生物學(xué)技術(shù)在鐵皮石斛研究中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；基因組學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0045－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.007

蘭科石斛屬鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）的干燥莖［1］，又名耳環(huán)石斛、黑節(jié)草、救命仙草等［2］。主要分布于安徽西南部（大別山）、四川、云南東南部［3］。鐵皮石斛在醫(yī)藥方面具有很高的藥用價值，既有滋陰清熱、益胃生津，又有抗癌和免疫調(diào)節(jié)等功效［4］。從現(xiàn)代藥理學(xué)角度來看，鐵皮石斛所含的多糖和芪類化合物，可以清除體內(nèi)過多的自由基以達(dá)到延緩器官衰老的作用，并且對肝癌、胃癌、宮頸癌等細(xì)胞均有抑制效應(yīng)［5］。鐵皮石斛作為我國的傳統(tǒng)中藥材，兼具藥物和保健的功效，是鐵皮石斛顆粒、石斛夜光片、鐵皮石斛膠囊、鐵皮石斛浸膏、鐵皮石斛含片等成藥的主要原料［6］。由于野生鐵皮石斛遭受人為采挖、生態(tài)環(huán)境破壞等原因，導(dǎo)致鐵皮石斛資源稀缺。再加上鐵皮石斛種子細(xì)小，成熟果實中的種子數(shù)量極多，呈粉塵狀，在自然環(huán)境中很難萌發(fā)，需要與某些真菌共生才能萌發(fā)，其野生資源已不多見［7］。國務(wù)院在1987年發(fā)布的《野生藥材資源保護(hù)管理條例》中將鐵皮石斛列為三級保護(hù)品種；1992年在《中國植物紅皮書》中被收載為瀕危植物［8］。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，鐵皮石斛分子生物學(xué)的研究已成為目前的熱點之一。國內(nèi)外學(xué)者采用分子生物學(xué)技術(shù)對鐵皮石斛開展了相關(guān)研究，在鐵皮石斛基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面取得了諸多進(jìn)展，這為鐵皮石斛基因克隆、基因編輯、基因轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)提供了研究基礎(chǔ)，也為鐵皮石斛植物的鑒別、植物生長發(fā)育及代謝調(diào)控機(jī)制等相關(guān)研究提供了新的思路和參考。但有關(guān)鐵皮石斛功能基因分析、分子鑒定等研究領(lǐng)域尚缺乏系統(tǒng)的總結(jié)，限制了對鐵皮石斛的進(jìn)一步開發(fā)和利用。鑒于此，本文從鐵皮石斛基因功能、分子鑒定、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等角度，對鐵皮石斛相關(guān)分子生物學(xué)研究成果進(jìn)行綜述，并對當(dāng)前的問題進(jìn)行探討，以期為該植物的保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)參考。

1基因組學(xué)研究

基因組數(shù)據(jù)可以為藥用植物提供遺傳基礎(chǔ)知識，以此來彌補(bǔ)植物遺傳和活性化學(xué)物之間的差距。由于鐵皮石斛基因組具有特殊的高雜合度和高重復(fù)性，使得最開始鐵皮石斛基因組測序的研究遇到了挑戰(zhàn)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，第二代Illumina高通量測序和第三代PacBio實時單分子測序的出現(xiàn)，多個課題組對鐵皮石斛基因組做出了解析。鐵皮石斛為二倍體單子葉的植物，染色體共有38條（2n=38），Yan等［9］采用二代測序（SGS）和三代測序（TGS）兩種技術(shù)進(jìn)行組裝得到了1.35Gb的鐵皮石斛全基因組序列，獲得了首個鐵皮石斛基因組草圖，觀察到存在有真菌共生、抗旱有關(guān)的基因家族有擴(kuò)張的趨勢，如調(diào)節(jié)氣孔密度和分布的SDD1基因，參與熱耐受和光敏色素信號通路的PPP7基因及3MAT等基因家族的擴(kuò)張可能和鐵皮石斛較強(qiáng)的抗旱能力有密切關(guān)聯(lián)。此外，研究者還分析了鐵皮石斛的主要藥用成分的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)參與多糖生成相關(guān)的SPS和SuSy基因大量重復(fù)，這為研究鐵皮石斛中石斛多糖積累的分子機(jī)制提供了思路，同時也為鐵皮石斛分子遺傳育種提供了潛在的靶標(biāo)基因。

與此同時，Zhang等［10］采用IIIuminaHiSeq2000測序平臺和SOAPdenovo2/Platanus組裝方式，對鐵皮石斛全基因組序列進(jìn)行研究，得到鐵皮石斛全基因組序列大小為1.01Gb，并預(yù)測了28910個蛋白編碼基因，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛存在和蝴蝶蘭類似的全基因組復(fù)制事件，同時也觀察到其基因組中部分基因家族典型的擴(kuò)張事件。其中比較典型的有：萜類合成相關(guān)TPS-a亞家族基因得到擴(kuò)張，家族成員基因數(shù)目遠(yuǎn)超過蝴蝶蘭，推測可能和石斛屬的種群擴(kuò)張有關(guān)，畢竟石斛屬擁有蘭科植物中最龐大的種群。鐵皮石斛基因組中抗性基因R基因家族也得到顯著的擴(kuò)張，達(dá)到了157個，R基因家族在植物的抗病過程中起著非常重要的作用，該基因家族的擴(kuò)張可能賦予鐵皮石斛更強(qiáng)大的病原免疫系統(tǒng)，幫助其在嚴(yán)酷的自然生境中生存。鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是植物中最重要的鈣離子傳感器，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中起著重要作用。Yang等［11］通過對鐵皮石斛全基因組分析，在鐵皮石斛中鑒定了24個編碼的鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）基因，試驗數(shù)據(jù)顯示，CDPK9-2和CDPK20-4分別與RbohD和RbohH相互作用，并參與了水楊酸/茉莉酸處理下過氧化氫的產(chǎn)生和氣孔孔徑的調(diào)控。Liu等［12］從鐵皮石斛基因組中鑒定了9個SPX家族基因，酵母雙雜交試驗結(jié)果表明，DoSPX4可與磷酸鹽高親和反應(yīng)因子（磷酸鹽高親和反應(yīng)因子）相互作用，結(jié)果突出了DoSPX4基因?qū)Φ土椎捻憫?yīng)作用。宋爭等［13］對鐵皮石斛phytocyanin基因家族的全基因組進(jìn)行分析，從鐵皮石斛全基因組中預(yù)測到包含PCLD結(jié)構(gòu)域的38個DoPCs，利用heatmap圖對DoPCs基因與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的種子的表達(dá)分析得出，有7個基因在種子共生萌發(fā)中有著上調(diào)的表達(dá)，這為研究鐵皮石斛與微生物共生的分子機(jī)制提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

完善的鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，為全基因組分析鑒定家族成員、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組分析、基因克隆等提供了有效資源和參考。也為研究鐵皮石斛生長發(fā)育、代謝調(diào)控、脅迫生長、闡明有關(guān)生物學(xué)路徑提供分子相關(guān)的信息支撐。

2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年來，鐵皮石斛基因組的解析為轉(zhuǎn)錄組研究提供了很好的參考，鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)呈現(xiàn)了良好的發(fā)展勢頭。截至目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)超過30項，這些研究主要集中在鐵皮石斛組織特異性基因挖掘、有效活性成分生物合成路徑的解析，抗逆信號通路挖掘以及生長發(fā)育機(jī)制、真菌共生機(jī)制等方面。目前已經(jīng)通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，挖掘出鐵皮石斛花、根、莖、葉等部位特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本2900余條，這些特異表達(dá)的基因可能在不同的器官中參與獨特的功能。研究表明，莖稈中發(fā)現(xiàn)的8個高豐度且特異表達(dá)基因可能參與碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝過程，在花中發(fā)現(xiàn)的25個特異基因可能參與石斛的開花調(diào)控，這些為鐵皮石斛重要性狀的基因功能解析提供了良好的研究基礎(chǔ)。

生物堿是在鐵皮石斛中最早發(fā)現(xiàn)的活性成分，存在于鐵皮石斛的根、莖、葉、花等多個組織部位，其中原球莖含量最高，通過不同組織轉(zhuǎn)錄組差異分析，獲得了一些可能參與調(diào)控鐵皮石斛生物堿合成的基因。如Wang［14］通過分析原球莖和葉片的轉(zhuǎn)錄組差異，獲得了41個顯著差異基因，其中包含參與生物堿生物合成途徑中的異胡豆苷-β-葡萄糖苷酶、縫籽木榛合成酶（Geissoschizinesynthase，GS）和Vinorine合成酶的候選基因，這有助于在今后的研究中分析鐵皮石斛生物堿的合成機(jī)制。鐵皮石斛中的多糖是各種組織中最豐富的活性化合物，而成熟莖中的含量最高，通過對不同組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘了鐵皮石斛果糖和甘露糖生物合成的代謝途徑，并推測8個纖維素酶合酶（CSLA）基因家族成員在莖中的特異表達(dá)模式與莖中高甘露糖含量性狀密切相關(guān)。此外，使用PacBio測序技術(shù)，檢測到鐵皮石斛中2個糖基轉(zhuǎn)移酶和4個纖維素合成酶基因存在可變剪切，而且2個編碼蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因在莖中的表達(dá)高于在葉中的表達(dá)，這些研究為進(jìn)一步研究鐵皮石斛富含多糖的分子機(jī)制提供了線索［15］。

此外，轉(zhuǎn)錄組被應(yīng)用于研究激素處理對鐵皮石斛藥效活性成分積累的影響。Niu等［16］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中水楊酸的存在可以增加鐵皮石斛幼苗中生物堿、多糖和類黃酮等生物活性成分的積累，轉(zhuǎn)錄組差異分析發(fā)現(xiàn)多達(dá)107個參與這些活性成分生物合成的基因在激素處理組被上調(diào)，這些研究為進(jìn)一步推測基因的功能提供信息，也為鐵皮石斛活性化合物含量的品種選育提供借鑒。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)也被用于研究鐵皮石斛的其他生理過程。在自然界中，由于自交不親和性，鐵皮石斛通常很少形成種子。Chen等［17］通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得41個可能參與自交不親和的基因，包括6個鈣離子信號基因和11個S位點受體激酶相關(guān)基因，這為鐵皮石斛的遺傳機(jī)制和種群保護(hù)提供了有益的見解。此外，鐵皮石斛種子細(xì)小，胚胎發(fā)育不全，自然界中鐵皮石斛種子的萌發(fā)往往依賴與菌根真菌的共生關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組研究表明內(nèi)源激素在鐵皮石斛種子共生萌發(fā)中起著至關(guān)重要的作用，接種菌根真菌后，種子與赤霉素（GA）生物合成相關(guān)的基因上調(diào)，因此推測GA3可能是鐵皮石斛種子萌發(fā)的關(guān)鍵信號分子［18］。這些結(jié)果為蘭科真菌共生和種子萌發(fā)提供了有價值的參考。

3基因克隆與功能研究

對鐵皮石斛功能基因的研究，可以揭示鐵皮石斛分子鑒定、生長發(fā)育、代謝調(diào)控機(jī)制等。目前，對鐵皮石斛功能基因的研究主要集中在生長發(fā)育調(diào)控基因、抗逆基因等。

3.1參與脅迫響應(yīng)的基因

在大自然中的植物，一般生長在干旱、鹽漬、高低溫度等環(huán)境中，這些環(huán)境對植物的生長發(fā)育起到一定的制約作用［19］。隨著植物在大自然的進(jìn)化，植物為了抵抗和適應(yīng)環(huán)境的脅迫，形成了一系列較為獨特的防御機(jī)制來降低環(huán)境對植物本身的損害［20］。多梳類（PcG）蛋白通過表達(dá)沉默同源異型基因來調(diào)控體節(jié)發(fā)育，PcG蛋白由兩個復(fù)合體構(gòu)成，分別是PRC1、PRC2，PRC2是負(fù)責(zé)標(biāo)記的沉默基因。仇漢林等［21］為了探討PRC2復(fù)合體對鐵皮石斛的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)的影響，通過熒光定量PCR檢測該基因?qū)Ψ巧锩{迫和病毒脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)PRC2復(fù)合體中的成員DoCLF在低溫、高溫和脫水等各種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)。植物中類受體激酶（RLK）在響應(yīng)生物、非生物脅迫因子中發(fā)揮極大的作用。高靜等［22］對鐵皮石斛RLK基因進(jìn)行克隆與分析，通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)DoRLK基因的轉(zhuǎn)錄本在鐵皮石斛根中表達(dá)較高，可以說明該基因參與植物組織的生長發(fā)育，可能影響根的形成，這進(jìn)一步揭示RLK基因在鐵皮石斛與環(huán)境互作中的功能關(guān)系。植物中的晚期胚胎富集蛋白（LEA）就是一種與植物抗逆性密切有關(guān)的蛋白，凌鴻等［23］以鐵皮石斛種子為材料，克隆DoLEA2基因并對其進(jìn)行分析，得出其參與鐵皮石斛的生長發(fā)育，且在高鹽脅迫的條件下通過表達(dá)積累來響應(yīng)環(huán)境脅迫，從而降低脅迫引起的對自身的損害。

3.2參與生長發(fā)育調(diào)控的基因

劉楚琪等［24］對鐵皮石斛氨基酸通透酶基因DoAAP2進(jìn)行克隆與分析，并通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在莖和葉中的表達(dá)量較高，推測該蛋白參與了植物的光合作用，并且對鐵皮石斛成熟種子處于培養(yǎng)過程中的7個時期進(jìn)行試驗分析，分別是：種胚活化期（P1）、原球莖形成期（P2）、原分生組織形成期（P3）、頂端分生組織形成期（P4）、橢球型原球莖期（P5）、葉原基維管系統(tǒng)形成期（P6）、根端分生組織形成期（P7），得出在P3、P4、P7時期的表達(dá)量較高，表明DoAAP2基因在鐵皮石斛的根、莖發(fā)育中起著重要的作用。在生物體中，要想實現(xiàn)對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的調(diào)控，其中依賴泛素或類泛素翻譯后的蛋白修飾起到重要的作用［25］，而泛素結(jié)合酶（UBC9）是唯一作用參與泛素化過程和類泛素化過程的泛素結(jié)合酶［26］。馬凌暉等［27］對鐵皮石斛UBC9進(jìn)行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)其在愈傷組織中表達(dá)量最高，在P1時期具有最高的表達(dá)量，可能促進(jìn)植物細(xì)胞的快速分裂、生長，并在鐵皮石斛的愈傷組織和種子活化期高度表達(dá)。李依民等［28］通過對鐵皮石斛ABC轉(zhuǎn)運蛋白F家族基因克隆及分析，從鐵皮石斛中分離到2個F家族ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因與F家族ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的相似性高達(dá)80%以上，均在葉中高度表達(dá)，暗示可能在鐵皮石斛生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。

在蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)控中蛋白磷酸酶是主要調(diào)控酶，屬于PP2Cs家族［29］，在植物中PP2Cs家族是調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶、脫落酸或受體激酶等信號的通路［30］。李依民等［31］對鐵皮石斛蛋白磷酸酶基因DoPP2C2進(jìn)行克隆與分析，獲得了基因全長及分子特征，為鐵皮石斛在生長發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)，同時為道地藥材形成機(jī)制的研究、良種培育提供了科學(xué)依據(jù)。劉亮亮等［32］克隆鐵皮石斛蛋白磷酸酶2A基因，其所在家族在調(diào)控植物生理代謝過程與基因分子的表達(dá)特征有著密切的關(guān)系，為揭示其在鐵皮石斛生長發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)。

3.3參與次生代謝相關(guān)的基因

鐵皮石斛的主要化學(xué)成分以多糖、生物堿、黃酮、萜類為主，其中多糖是鐵皮石斛較為主要的活性成分之一。鐵皮石斛中的多糖類可通過增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的作用來清除人體內(nèi)的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，達(dá)到抗氧化的作用［33-35］。張春柳等［36］從鐵皮石斛原球莖中克隆了2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別是DoGAUT1、DoPGSIP6，發(fā)現(xiàn)T1表達(dá)合成多糖，符合次生代謝的積累規(guī)律，P6大量合成胞外多糖。在植物次生代謝中，查爾酮合成酶（CHS）是黃酮類化合物合成的第一關(guān)鍵酶［37］；孟衡玲等［38］對鐵皮石斛中的CHS基因進(jìn)行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)該基因在鐵皮石斛的早期參與激素運輸和植物器官形態(tài)的形成，在后期主要參與類黃酮物質(zhì)的形成；林艷君等［39］采用同源克隆的方法克隆得到鐵皮石斛Do-HDR基因，用滅活的尖孢鐮刀菌菌液作為誘導(dǎo)子，設(shè)置不同的濃度梯度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)子為200mg/L時，總生物堿的含量達(dá)到最大，可以推測該基因與鐵皮石斛中生物堿的合成、積累有關(guān)。

3.4參與休眠解除和菌根互作相關(guān)的基因

鐵皮石斛是一種獨特的菌根植物，在生長過程中，真菌會侵染其根皮層，為鐵皮石斛的生長提供一定的營養(yǎng)支撐，從而促進(jìn)幼苗的萌發(fā)、植株生長、增強(qiáng)植株的抗性，是提高鐵皮石斛的生長速率和成活率的關(guān)鍵因素［40］。鐵皮石斛在生長過程中幾乎都是與真菌共生的，這種共生關(guān)系伴隨著鐵皮石斛的整個生活史。楊前宇［41］從11種蘭屬植物分離獲得1450株菌根真菌、從41種石斛屬植物分離獲得1434株菌根真菌，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的種子與酶胞膠膜菌中CaM和CML所在的基因家族參與生物學(xué)調(diào)控。趙明明等［42］首次從鐵皮石斛種子中分離得到一個鈣依賴蛋白激酶（CDPK），數(shù)據(jù)分析顯示DoCDPK1、DoCDPK32-like基因在種子中接菌共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)中均有上調(diào)表達(dá)，可以暗示該基因在種子萌發(fā)、真菌共生等信號傳導(dǎo)中起著調(diào)控的作用。張崗等［43］利用小菇真菌來浸染鐵皮石斛根部克隆得到一個促分裂原活化蛋白激酶基因（DoMPK1），結(jié)果表明：該基因可能參與小菇-鐵皮石斛菌根共生互作。

4轉(zhuǎn)基因研究

1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物，到目前對轉(zhuǎn)基因植物的研究已經(jīng)取得了突破性的飛躍。目前報道的對遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、農(nóng)桿菌子房注射法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在水稻、小麥、玉米等植物得到廣泛的應(yīng)用。利用一些分子技術(shù)將外源目的基因插入到受體植物中，通過篩選和培養(yǎng)來獲得具有抗性的植株，且轉(zhuǎn)化后的植株具有較穩(wěn)定的遺傳表達(dá)［44］。龔延鋒等［45］對鐵皮石斛阿拉伯吡喃糖變位酶（DoUAM）進(jìn)行克隆與分析，將目的基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)DoUAM基因與對照組相比生長緩慢、葉片較瘦小，以此分析基因可能與植物的發(fā)育有關(guān)。崔波等［46］以鐵皮石斛的原球莖為受體，在摁壓條件下，原球莖在濃度為200μmol/L的乙酰丁香酮菌液中浸染30min，培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入美羅培南、草甘膦篩選的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化的效率最高，這為研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了幫助。楊雪飛等［47］利用基因槍轟擊類原球莖法，將大麥中的抗旱耐鹽堿的基因lea3導(dǎo)入鐵皮石斛中，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽等脅迫的能力提高，這為鐵皮石斛新品種的選育邁進(jìn)了一步。陳璐等［48］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）基因?qū)霟o菌鐵皮石斛原球莖中，Rubisco基因在植物光合作用的葉綠體中存在，由此發(fā)現(xiàn)該基因?qū)μ岣咧参锏墓夂献饔闷鹬匾饔谩Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD600=0.9，浸染時間為30min，特美汀（TMT）的濃度為50mg/L，潮霉素（Hyg）濃度為55mg/L時遺傳轉(zhuǎn)化率最高。武榮花等［49］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）的反義基因?qū)﹁F皮石斛原球莖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得出用刀切法來處理原球莖，在乙酰丁香酮（AS）濃度為100μmol/L、農(nóng)桿菌菌液OD600=0.8條件下，浸染時間為30min，共培養(yǎng)的時間為60h，最后接種到含有30mg/LMer和3.0mg/L草甘膦（PPT）的培養(yǎng)基中，遺傳轉(zhuǎn)化的效率最高。

5基因編輯

植物基因功能鑒定和新品種的選育很大程度上離不開植物突變體的獲得，通過自然突變、化學(xué)、物理誘導(dǎo)等方法，出現(xiàn)突變效率低、突變位點隨機(jī)，很難得到確定的突變基因［50］。通過CRISPR/CAS9編輯技術(shù)可以實現(xiàn)精準(zhǔn)的基因編輯作用。在單子葉植物和雙子葉植物抗病性基因改良中，采用CRISPR技術(shù)可以切除入侵病毒和外源DNA，從而達(dá)到保護(hù)自身免受侵害的作用［51］。研究表明鐵皮石斛中的多糖和纖維素含量呈負(fù)相關(guān)，胡淞等［52］為了減少鐵皮石斛中的纖維含量，利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建敲除載體，獲得Csl4基因突變體，發(fā)現(xiàn)突變體植株能降低鐵皮石斛莖中的纖維素合成。SEP3基因在鐵皮石斛花器官的形成和發(fā)育中起著重要作用，黃鑫等［53］利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建基因敲除載體，并使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得陽性原球莖，這為SEP3基因在鐵皮石斛基因表達(dá)的研究提供了幫助。Kui等［54］基于先前開發(fā)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，鑒定了幾種外源性基因表達(dá)的高效啟動子，并成功應(yīng)用于CRISPR/CAS9編輯基因組中的內(nèi)源基因。

6結(jié)語與展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代高通量測序技術(shù)的開發(fā)在鐵皮石斛的分子生物學(xué)研究中起著很大的推動作用。然而，由于鐵皮石斛自身的特征和地理分布，加上其分子生物學(xué)研究的團(tuán)隊力量薄弱、資金投入不足等原因，導(dǎo)致分子生物技術(shù)在鐵皮石斛的應(yīng)用方面存在很多難點。目前利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆等技術(shù)對鐵皮石斛的功能基因的研究取得了一定的進(jìn)展，但主要集中在對鐵皮石斛生長發(fā)育、次生代謝、脅迫相關(guān)的基因方面，對其他相關(guān)基因研究甚少。在未來對功能基因的研究中，可以充分利用CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)，通過基因編輯關(guān)鍵功能基因來提高功能基因的表達(dá)，雖然CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)存在脫靶等問題，但相信隨著對編輯技術(shù)的不斷研究深入，脫靶等問題將會逐漸完善并得到解決，從而為鐵皮石斛功能基因組的研究提供新的思路。

（責(zé)任編輯：胡吉鳳）

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