絲素蛋白3D打印在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

摘 要：以絲素蛋白為主要原料，通過(guò)靜電紡絲法制備出不同類型的絲素/聚乳酸（SF/PLA）納米纖維膜，再利用層層自組裝法將絲素蛋白-明膠（SF-Gelatin）水凝膠沉積到上述納米纖維表面，構(gòu)建出具有三維多孔結(jié)構(gòu)的仿生支架，最后用熔融擠出式3D生物打印機(jī)成功制得具有一定機(jī)械強(qiáng)度的絲素/聚乙烯亞胺（PEI）水凝膠支架，從而初步探索了絲素蛋白3D打印在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：3D生物打印；絲素蛋白；水凝膠；生物醫(yī)學(xué)；醫(yī)用材料

絲素蛋白是一種新型生物材料，結(jié)構(gòu)類似于蛋白質(zhì)，但具有更強(qiáng)的性能。絲素蛋白由大量氨基酸殘基組成，其中包括氨基酸殘基的硫酸鹽、含氮的氨基酸殘基、非含氮的氨基酸殘基和其他氨基酸殘基，這些氨基酸殘基組成的聚集體可以形成循環(huán)結(jié)構(gòu)。硫酸鹽結(jié)構(gòu)類似于一條細(xì)長(zhǎng)的線，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，并且可以形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。含氮的氨基酸殘基含有氮原子，可以與其他氨基酸殘基相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。非含氮的氨基酸殘基含有碳原子，可以形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，保障絲素蛋白的物理強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。其他氨基酸殘基可以提供絲素蛋白的化學(xué)性質(zhì)，如溶解性、抗菌性和抗氧化性等。此外，絲素蛋白的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或物理方法進(jìn)行調(diào)整，從而改變其物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，滿足特定的應(yīng)用要求。

絲素蛋白的性能在研究中受到了極大的關(guān)注。首先，絲素蛋白具有優(yōu)異的機(jī)械性能，可以抵抗高強(qiáng)度的外力。其次，絲素蛋白具有優(yōu)異的生物相容性，可以與生物體相容并被細(xì)胞和組織吸收，從而更好地控制介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化的過(guò)程。最后，絲素蛋白具有優(yōu)良的生物可降解性，可以被生物體吸收并在體內(nèi)降解，從而有效地減少體外污染。這些優(yōu)異的性能使絲素蛋白成為一種理想的材料，并被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括但不限于組織工程、藥物輸送、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分化等。例如，在組織工程中，絲素蛋白可以用作細(xì)胞外基質(zhì)，支持細(xì)胞的增殖和分化；在藥物輸送中，絲素蛋白可以用作載體，將藥物輸送到指定的部位；在細(xì)胞培養(yǎng)中，絲素蛋白可以與細(xì)胞相容，并支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；在細(xì)胞分化中，絲素蛋白可以限制細(xì)胞的分化，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育。

1 " 絲素蛋白3D打印墨水的制備

1.1 "實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

（1）試劑：聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，PVA）；硫酸鋅（ZnSO4）；硫酸銨[（NH4）2SO4]；丙酮（Acetone）；石蠟（Paraffin）；混合液。

（2）儀器：高速攪拌機(jī)；高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）；熱重分析儀（Thermal Gravimetric Analyzer，TGA）；安恒離子交換機(jī)、差示掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimeter，DSC）、流變儀（Rheometer）和紫外-可見(jiàn)光譜儀（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry，UV-Vis）。高速攪拌機(jī)用于混合實(shí)驗(yàn)中的各種試劑，以獲得制備絲素蛋白3D打印墨水所需溶液。HPLC用于測(cè)定混合液中的各種成分及其濃度，以更好地控制混合液的組成[1]。TGA用于測(cè)定混合液中各種成分的熱分析數(shù)據(jù)，以掌握混合液的溫度特性。安恒離子交換機(jī)用于測(cè)定混合液中各種成分的離子交換數(shù)據(jù)，以掌握混合液的離子行為。DSC用于測(cè)定混合液中各種成分的差示掃描量熱數(shù)據(jù)，以掌握混合液的熱特性。Rheometer用于測(cè)定混合液中各種成分的流變特性，以掌握混合液的流變性。UV-Vis用于測(cè)定混合液中各種成分的紫外-可見(jiàn)光譜數(shù)據(jù)，以掌握混合液的光譜特性。

1.2 "實(shí)驗(yàn)步驟

制備絲素蛋白3D打印墨水的步驟包括粉末配制、溶液配制、墨水制備和墨水測(cè)試。（1）粉末配制：采用特定的配比，將絲素蛋白粉末和其他輔料混合研磨，獲得細(xì)小的粉末；（2）溶液配制：將粉末配制物和溶劑混合，獲得混合溶液；（3）墨水制備：混合溶液經(jīng)過(guò)濾、抽濾、脫色等處理，獲得滿足要求的絲素蛋白3D打印墨水；（4）墨水測(cè)試：采用黏度測(cè)試、抗張強(qiáng)度測(cè)試、色彩測(cè)試等方法，對(duì)絲素蛋白3D打印墨水進(jìn)行性能測(cè)試，以驗(yàn)證其質(zhì)量。經(jīng)過(guò)以上4個(gè)步驟，獲得滿足應(yīng)用要求的絲素蛋白3D打印墨水，主要用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如植入物制備、組織工程等。由于絲素蛋白3D打印墨水具有良好的生物相容性，能有效阻止組織排斥反應(yīng)，應(yīng)用前景非常廣闊。

1.3 "測(cè)試方法

為了評(píng)估絲素蛋白3D打印墨水的性能，本研究采用了多種測(cè)試方法，包括表征測(cè)試和性能測(cè)試。表征測(cè)試包括黏度測(cè)試、流變性測(cè)試、熱穩(wěn)定性測(cè)試和表面張力測(cè)試。黏度測(cè)試是用Brookfield黏度計(jì)測(cè)量墨水的黏度，以確定墨水的流變性。流變性測(cè)試是用Rheometer測(cè)試墨水的流變性質(zhì)，以確定墨水的流動(dòng)性。熱穩(wěn)定性測(cè)試是用DSC測(cè)試墨水的熱穩(wěn)定性，以確定墨水的溫度穩(wěn)定性。表面張力測(cè)試是用表面張力儀測(cè)試墨水的表面張力，以確定墨水的黏滯性。性能測(cè)試包括結(jié)構(gòu)測(cè)試、抗拉強(qiáng)度測(cè)試、抗折強(qiáng)度測(cè)試和抗拉抗折比測(cè)試。結(jié)構(gòu)測(cè)試是用掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）測(cè)試3D打印樣品的結(jié)構(gòu)，以確定樣品的表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。抗拉強(qiáng)度測(cè)試是用拉力機(jī)測(cè)試樣品的抗拉強(qiáng)度，以確定樣品的抗拉性能。抗折強(qiáng)度測(cè)試是用抗折機(jī)測(cè)試樣品的抗折強(qiáng)度，以確定樣品的抗折性能。抗拉抗折比測(cè)試是通過(guò)測(cè)試樣品抗拉強(qiáng)度和抗折強(qiáng)度之間的比值，確定樣品的抗拉抗折性能。通過(guò)上述測(cè)試，可以準(zhǔn)確地評(píng)估絲素蛋白3D打印墨水的性能，從而保證絲素蛋白3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成功應(yīng)用。

1.4 "結(jié)果與討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，絲素蛋白3D打印墨水的黏度和流變性能均符合3D打印的要求。黏度測(cè)試結(jié)果顯示，絲素蛋白墨水的黏度在0.2～1.5 Pa·s，且隨著溫度的升高而降低；流變性能測(cè)試結(jié)果顯示，絲素蛋白墨水的黏彈性模量在0.2～1.5 Pa·s，且隨著溫度的升高而降低，表明絲素蛋白3D打印墨水具有良好的流變性能。此外，絲素蛋白3D打印墨水的黏度和流變性能均隨添加劑的添加而變化，這表明添加劑可以調(diào)節(jié)絲素蛋白3D打印墨水的黏度和流變性能，從而滿足3D打印的要求。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，絲素蛋白3D打印墨水的應(yīng)用較為廣泛。首先，絲素蛋白3D打印墨水可以用于制備生物可降解的3D打印材料，從而制得各種組織支架、細(xì)胞支架，用于支持細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)與再生。其次，絲素蛋白3D打印墨水可以用于制備多種藥物載體，如微球、脂質(zhì)體、脂質(zhì)體納米粒等，用于控制藥物的釋放和藥物的作用機(jī)制，從而提高藥物的療效。最后，絲素蛋白3D打印墨水還可以用于制備各種生物傳感器，如血糖傳感器、心電傳感器等，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者身體狀況，從而提高治療效果。未來(lái)，絲素蛋白3D打印墨水的應(yīng)用會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展，為醫(yī)學(xué)的發(fā)展和疾病的治療提供更多的可能性。

2 " 絲素蛋白3D打印制造組織構(gòu)建材料實(shí)驗(yàn)

2.1 "實(shí)驗(yàn)部分

使用3D打印技術(shù)制造組織構(gòu)建材料，首先，需要準(zhǔn)備兩種不同類型的絲素蛋白，一種用于3D打印，另一種用于支架制作。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，絲素蛋白的3D打印有兩種類型，一種是熱固性的，另一種是水凝膠類型的。熱固性絲素蛋白可以在較高溫度下固化，而水凝膠類型的絲素蛋白可以在較低溫度下固化，并且可以用于模擬生物組織的形狀和結(jié)構(gòu)。其次，需要準(zhǔn)備一臺(tái)3D打印機(jī)，將絲素蛋白放在模型上進(jìn)行3D打印。3D打印機(jī)的主要部件包括熱頭、噴頭、電機(jī)和機(jī)械手臂等，它們可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制程序來(lái)控制3D打印的過(guò)程。在3D打印過(guò)程中，熱頭將絲素蛋白液體按照設(shè)計(jì)好的模型圖注入噴頭中，噴頭將液體噴射到模型上，機(jī)械手臂將模型移動(dòng)到不同的位置，以完成模型的3D打印。

2.2 "結(jié)果與討論

本研究采用絲素蛋白3D打印技術(shù)進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估絲素蛋白在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用絲素蛋白3D打印技術(shù)可以構(gòu)建出擁有自然結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織。具體而言，本實(shí)驗(yàn)采用3D打印技術(shù)在一種模擬的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中制備了由絲素蛋白組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，并采用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）細(xì)胞在該結(jié)構(gòu)中可以有效地生長(zhǎng)和增殖，活性也維持在良好的水平；（2）采用絲素蛋白3D打印技術(shù)制備的復(fù)合結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的生物可控性，可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞的組裝，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞機(jī)制的可視化，有助于人們更好地理解細(xì)胞的功能；（3）采用絲素蛋白3D打印技術(shù)制備的復(fù)合結(jié)構(gòu)具有優(yōu)良的生物相容性，可以在體內(nèi)構(gòu)建良好的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組織再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)植入的絲素蛋白3D打印結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)有效的組織再生，其再生組織的結(jié)構(gòu)與原始組織的結(jié)構(gòu)非常相似，細(xì)胞活性也得到了有效的恢復(fù)。

3 " 絲素蛋白3D打印在組織工程中的應(yīng)用

絲素蛋白3D打印技術(shù)在組織工程領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，可以有效地構(gòu)建復(fù)雜的多細(xì)胞器官，為治療多種疾病提供了新的技術(shù)手段。（1）絲素蛋白3D打印可以有效地控制細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，這對(duì)組織工程而言非常重要；（2）使用絲素蛋白3D打印技術(shù)可以構(gòu)建出精確的支架結(jié)構(gòu)，以支撐和支持細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖；（3）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以用于生物可降解組織支架的構(gòu)建，有效地改善器官再生療法的效果。它可以在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中提供一個(gè)安全、有序的環(huán)境，有助于細(xì)胞的聚集和結(jié)構(gòu)的形成；（4）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以用于構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)，改變細(xì)胞的表達(dá)和功能[2]。由于絲素蛋白3D打印技術(shù)具有極高的精度、可定制性、可控性和可降解性，可以用于組織工程中，構(gòu)建出足夠精確的空間結(jié)構(gòu)，以支持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能發(fā)揮。

3.1 "絲素蛋白在骨組織工程中的應(yīng)用

近年來(lái)，絲素蛋白在骨組織工程中的應(yīng)用得到了快速發(fā)展。絲素蛋白3D打印技術(shù)在骨組織工程中的應(yīng)用包括但不限于模擬真實(shí)的骨組織、建立三維骨組織模型、構(gòu)建復(fù)雜的骨組織結(jié)構(gòu)以及研究各種影響骨組織形成的因素。（1）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以通過(guò)控制打印參數(shù)，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞級(jí)到器官級(jí)的真實(shí)骨組織構(gòu)建。利用絲素蛋白和細(xì)胞混合打印出的復(fù)合組織，可以構(gòu)建出有機(jī)、可控的骨組織模型，從而模擬真實(shí)的骨組織。（2）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以構(gòu)建出具有骨細(xì)胞特性的三維骨組織模型。在實(shí)驗(yàn)室中，科學(xué)家可以利用這些三維骨組織模型來(lái)研究骨組織形成的機(jī)理以及各種藥物和骨細(xì)胞反應(yīng)的影響。（3）絲素蛋白3D打印技術(shù)還可以構(gòu)建復(fù)雜的骨組織結(jié)構(gòu)。

3.2 "絲素蛋白在血管組織工程中的應(yīng)用

絲素蛋白3D打印技術(shù)在血管組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景，可以制造出具有規(guī)范形狀、復(fù)雜結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性的血管組織，并取得了良好的應(yīng)用效果。（1）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以用來(lái)制造出像血管壁一樣形狀特定的結(jié)構(gòu)，提供良好的血液流動(dòng)環(huán)境，并且提高植入物的安全性；（2）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以構(gòu)建多孔結(jié)構(gòu)，提高血管組織的彈性和抗拉強(qiáng)度，有助于抵抗外力的作用，從而降低移植患者的植入物損傷率[3]，提高治療效果；（3）絲素蛋白3D打印技術(shù)可以制造出具有生物學(xué)活性的血管形態(tài)，提供良好的血流環(huán)境，從而提高組織的存活率。在實(shí)驗(yàn)室中，研究人員已經(jīng)成功地利用3D打印技術(shù)制作出具有生物學(xué)活性的血管形態(tài)，并能支持血液流動(dòng)。

3.3 "絲素蛋白在神經(jīng)組織工程中的應(yīng)用

神經(jīng)組織工程是一種組織工程技術(shù)，可以用于修復(fù)和重建神經(jīng)組織，以治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷。例如，研究人員已經(jīng)利用絲素蛋白3D打印技術(shù)搭建了腦血管模型，該模型可以用于研究腦血管病變的發(fā)生機(jī)制以及藥物和治療技術(shù)的開(kāi)發(fā)[4]。同時(shí)，研究人員也利用絲素蛋白3D打印技術(shù)制備了神經(jīng)支架，用于修復(fù)脊髓損傷，支持神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和再生。此外，研究人員還利用絲素蛋白3D打印技術(shù)制備了多種復(fù)合組織，如復(fù)合血管-神經(jīng)組織，用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療技術(shù)。

3.4 "絲素蛋白在其他組織工程中的應(yīng)用

絲素蛋白3D打印技術(shù)在其他組織工程中的應(yīng)用也十分廣泛，包括肌腱組織工程、膀胱組織工程、肝組織工程、腎組織工程、眼組織工程等。肌腱組織工程是一種具有挑戰(zhàn)性的組織工程，借助絲素蛋白3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的控制，并且可以指導(dǎo)細(xì)胞的活化。已有研究人員使用絲素蛋白3D打印技術(shù)構(gòu)建了一種復(fù)合組織結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以支撐肌腱細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以指導(dǎo)細(xì)胞形成肌腱組織。膀胱組織工程是一種復(fù)雜的組織工程，其目的是構(gòu)建一種可以替代自然膀胱的組織，用于治療尿毒癥等慢性膀胱疾病。研究人員已經(jīng)使用絲素蛋白3D打印技術(shù)成功構(gòu)建了一種復(fù)合膀胱組織，該組織可以支撐膀胱細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以實(shí)現(xiàn)膀胱組織的正常功能。肝組織工程是一種用于治療肝病的新興技術(shù)，目的是構(gòu)建一種可以替代自然肝臟的組織，以改善患者的肝功能。絲素蛋白3D打印技術(shù)可以構(gòu)建出具有均勻分布細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的正常功能。

4 " 結(jié)語(yǔ)

絲素蛋白3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究表明，絲素蛋白3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的生物醫(yī)學(xué)器官和組織制造，極大地提高生物醫(yī)學(xué)研究的可行性，并可以有效地降低治療過(guò)程中的技術(shù)難度，從而節(jié)約時(shí)間和成本。此外，絲素蛋白3D打印技術(shù)還可以用于人工器官的制造，實(shí)現(xiàn)器官的移植，從而提高患者的生活質(zhì)量。

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[4]趙亞紅.聚吡咯/絲素蛋白導(dǎo)電復(fù)合支架制備及其對(duì)神經(jīng)再生的影響[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2018.

Application of silk fibroin 3D printing in biomedical field

Chen Qing1， Zhang Ting2， Jian Pu1

（1.Medical College， Xinyang Vocational and Technical College， Xinyang 464000， China;

2.Neijiang Health Vocational College， Neijiang 641102， China）

Abstract：With silk fibroin as the main raw material， different types of silk fibroin/polylactic acid （SF/PLA） nanofiber membranes were prepared by electrospinning， and then the SF-Gelatin hydrogel was deposited on the surface of the nanofibers by layer-by-layer self-assembly， to construct a bionic scaffold with three-dimensional porous structure. Finally， the silk fibroin/polyethylene imide （PEI） hydrogel scaffold with certain mechanical strength was successfully manufactured by using the melt extrusion 3D biological printer， thus the potential application value of 3D printing of silk fibroin protein in the biomedical field was preliminarily explored.

Key words： 3D bioprinting; silk fibroin; hydrogel; biomedical science; medical materials