乙酸鈉對(duì)氧糖剝奪皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的作用及HIF-1α表達(dá)的影響

［摘要］ 目的 探討乙酸鈉（NaAc）對(duì)氧糖剝奪（OGD）損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元的作用及低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)的影響。

方法 將OGD處理的皮質(zhì)神經(jīng)元作為腦缺血模型，采用細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（CCK-8）、乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NaAc處理后的神經(jīng)元存活情況，Western blot方法檢測(cè)OGD損傷后、NaAc處理后神經(jīng)元中HIF-1α蛋白表達(dá)；應(yīng)用二甲基草酰甘氨酸（DMOG）、HIF-1α抑制劑（LW6）分別激動(dòng)和抑制HIF-1α，觀察NaAc是否通過抑制HIF-1α發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察NaAc處理后大鼠腦組織梗死體積。

結(jié)果 TTC結(jié)果顯示，NaAc處理可以減輕腦梗死體積（F=107.20，Plt;0.05）。體內(nèi)細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示，NaAc可以減輕OGD對(duì)神經(jīng)元的損傷（F=98.80、72.62，Plt;0.05），NaAc通過抑制HIF-1α表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元存活（F=43.57、97.52，Plt;0.05）。Western blot結(jié)果顯示，NaAc可抑制正常神經(jīng)元中HIF-1α蛋白的表達(dá)（t=7.84，Plt;0.05），OGD損傷后神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)增加（t=9.96，Plt;0.05），NaAc可抑制OGD損傷后神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)（F=74.74，Plt;0.05）。

結(jié)論 OGD損傷后，補(bǔ)充NaAc可通過抑制HIF-1α蛋白表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］ 乙酸鈉；腦缺血；再灌注損傷；神經(jīng)保護(hù)；大腦皮質(zhì)

［中圖分類號(hào)］ R743.31;R338.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096-5532（2023）01-0001-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.011

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.1118.007.html;2023-03-06 10：56：03

EFFECT OF SODIUM ACETATE ON CORTICAL NEURONAL INJURY CAUSED BY OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION AND ITS INFLUENCE ON THE EXPRESSION OF HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR 1α

（The Institute of Neuroregeneration and Neurorehabilitation， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ "Objective nbsp;To investigate the effect of sodium acetate （NaAc） on cortical neurons after oxygen-glucose deprivation （OGD） injury and its influence on the expression of hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α）.

Methods "Cortical neurons treated with OGD were established as a model of cerebral ischemia. CCK-8 assay and lactate dehydrogenase （LDH） release assay were used to measure the viability of neurons treated with NaAc; Western blot was used to measure the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury and NaAc treatment; HIF-1α was stimulated by dimethyloxalylglycine and inhibited by an HIF-1α inhibitor （LW6） to observe whether NaAc exerts a neuroprotective effect by inhibiting HIF-1α. The 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining was used to observe cerebral infarct volume of the rats treated with NaAc.

Results "TTC staining showed that NaAc treatment reduced cerebral infarct volume （F=107.20，Plt;0.05）. In vivo cell survival test and LDH release assay showed that NaAc alleviated neuronal injury caused by OGD （F=98.80，72.62;Plt;0.05） and promoted the survival of neurons by inhibiting HIF-1α expression （F=43.57， 97.52;Plt;0.05）. Western blot showed that NaAc inhibited the protein expression of HIF-1α in normal neurons （t=7.84，Plt;0.05）， and there was a significant increase in the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury （t=9.96，Plt;0.05）， while NaAc inhibited the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury （F=74.74，Plt;0.05）.

Conclusion "NaAc supplementation exerts a neuroprotective effect after OGD injury by inhibiting the protein expression of HIF-1α.

［KEY WORDS］ "sodium acetate；brain ischemia; reperfusion injury; neuroprotection; cerebral cortex

缺血性卒中是由原位血栓或來自另一個(gè)動(dòng)脈或心臟的栓塞的動(dòng)脈梗阻引起的，是全球第三大死亡原因［1］。考慮到溶栓和手術(shù)治療缺血性卒中的效果有限而且預(yù)后不佳，需要新的治療方式來改善卒中的預(yù)后。低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是由β亞基和α亞基組成的異二聚體。泛素依賴性蛋白酶根據(jù)氧氣含量調(diào)節(jié)α亞基水平［2-3］。研究表明，HIF-1α有一定神經(jīng)保護(hù)作用［4］。乙酸鈉（NaAc）是一種短鏈脂肪酸。已有研究表明，含有醋酸酯的短鏈脂肪酸有抑制炎癥作用［5］。NaAc在缺血性腦卒中動(dòng)物及細(xì)胞模型中作用研究甚少。本研究利用大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型及氧糖剝奪（OGD）處理的皮質(zhì)神經(jīng)元作為腦缺血模型，探究NaAc對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元損傷的作用及HIF-1α水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量為250～300 g，購自青島大仁福成牧業(yè)有限公司。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只。飼養(yǎng)條件：光照/黑暗周期為12/12 h，房間溫度23～25 ℃，自由獲取食物和水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)3 d。

1.1.2 主要的實(shí)驗(yàn)試劑 NaAc購自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；二甲基草酰甘氨酸（DMOG）購自CSNpharm公司；兔來源抗HIF-1α多克隆抗體、抗MAP2多克隆抗體購自CST公司；HIF-1α抑制劑（LW6）、乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自北京Bioss生物技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 采用相關(guān)文獻(xiàn)的方法［6］，原代培養(yǎng)6批神經(jīng)元，分別用于Western blot檢測(cè)、免疫熒光染色、細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（CCK-8）和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 氧糖剝奪/復(fù)氧模型（OGD/R模型）的制備

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法［7］，采用OGD/R處理神經(jīng)元，以其作為OGD/R模型。

1.2.3 缺血再灌注損傷模型制備及TTC染色 采用線栓梗死技術(shù)制備大鼠缺血再灌注損傷模型 ［8］。將SD大鼠分為Sham組（假手術(shù)對(duì)照）、MCAO組（制備缺血再灌注損傷模型）、MCAO+NaAc組（制備缺血再灌注損傷模型并腹腔注射NaAc），各6只。觀察各組大鼠腦梗死體積。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 采用相關(guān)文獻(xiàn)方法［8］。將原代培養(yǎng)神經(jīng)元分為3批，第1批分為Sham組（未做處理）和NaAc組（加入NaAc），觀察NaAc對(duì)HIF-1α蛋白水平的影響；第2批分為Sham組（未做處理）和OGD/R 6 h組（給予神經(jīng)元OGD/R處理），觀察OGD后神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α蛋白水平的變化；第3批分為Sham組（未做處理）、OGD組（給予神經(jīng)元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經(jīng)元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對(duì)OGD后HIF-1α蛋白水平的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.5 免疫熒光染色 采用相關(guān)文獻(xiàn)方法［8］，將原代培養(yǎng)神經(jīng)元分為Sham組（未做處理）、OGD組（給予神經(jīng)元OGD處理）和OGD+NaAc組（神經(jīng)元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對(duì)OGD后神經(jīng)元存活的影響。

1.2.6 CCK-8比色法以及LDH釋放實(shí)驗(yàn) 采用相關(guān)文獻(xiàn)的方法［8］，將神經(jīng)元分為2批，第1批分為Control組（未做處理）、Control+NaAc組（加入NaAc）、OGD組（給予神經(jīng)元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經(jīng)元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對(duì)OGD后神經(jīng)元存活的影響；第2批分為Control組（未做處理）、OGD組（給予神經(jīng)元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經(jīng)元OGD之后加入NaAc處理）、OGD+NaAc+DMOG組（神經(jīng)元OGD后加入NaAc和DMOG）、OGD+NaAc+LW6組（神經(jīng)元OGD后加入NaAc和LW6），觀察HIF-1α表達(dá)對(duì)NaAc調(diào)節(jié)的損傷神經(jīng)元存活的影響。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本比較t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 NaAc對(duì)缺血損傷后大鼠腦梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果示，Sham組、MCAO組、MCAO+NaAc組大鼠腦梗死體積分別為0、32.89±5.05、19.36±3.57，各組比較差異有顯著性（F=107.20，Plt;0.05），MCAO+NaAc組腦梗死體積明顯小于MCAO組（t=5.988，Plt;0.05）。見圖1。

2.2 NaAc對(duì)OGD損傷后神經(jīng)元的影響

CCK-8比色檢測(cè)顯示，各組神經(jīng)元存活率差異有顯著性（F=98.80，Plt;0.05）。與Control組相比，OGD組細(xì)胞存活率降低（t=14.29，Plt;0.05）；與OGD組相比，OGD+NaAc組細(xì)胞存活率增加（t=5.94，Plt;0.05）。LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示，各組LDH釋放率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.62，Plt;0.05）。與Control組相比，OGD組LDH釋放率明顯升高（t=11.35，Plt;0.05）；與OGD組相比較，OGD+NaAc組LDH釋放率降低（t=2.75，Plt;0.05）。見表1。

2.3 NaAc對(duì)正常神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

NaAc組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯下降（t=7.84，Plt;0.05）。見圖2。

2.4 缺血再灌注損傷后神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與Sham組相比較，OGD/R 6 h 組HIF-1α蛋白表達(dá)明顯上升（t=9.96，Plt;0.05）。見圖3。

2.5 NaAc對(duì)OGD損傷神經(jīng)元HIF-1α表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組相比較，OGD組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高（F=74.74，t=11.62，Plt;0.05）；與OGD組相比，OGD+NaAc組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯降低（t=9.11，Plt;0.05）。見圖4。

2.6 HIF-1α蛋白表達(dá)對(duì)NaAc調(diào)節(jié)的神經(jīng)元存活的影響

CCK-8比色及LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示，與OGD+NaAc組相比較，OGD+NaAc+DMOG組細(xì)胞存活率降低（F=43.57，t=10.12，Plt;0.05），LDH釋放率增高（F=97.52，t=3.28，Plt;0.05）；而OGD+NaAc+LW6組的細(xì)胞存活率升高（t=4.49，Plt;0.05），LDH釋放率降低（t=3.37，Plt;0.05）。見表2。

3 討" 論

缺血性腦卒中可直接造成大腦不可逆的細(xì)胞損傷，或在半暗帶引起一系列病理生理過程，引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致?lián)p傷后梗死體積增加［10］。

短鏈脂肪酸是厭氧細(xì)菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是微生物群與宿主組織之間的紐帶［11］。胃腸道和血液中脂肪酸濃度的改變可能會(huì)誘發(fā)或預(yù)防病理性疾病，如癌癥、糖尿病等。NaAc是由不可消化的食物殘?jiān)湍c道內(nèi)內(nèi)源性上皮源性黏液厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的。腸腔中釋放的短鏈脂肪酸很容易被結(jié)腸細(xì)胞吸收并用作能量來源。正常情況下，人血清中的乙酸鹽水平較低［12］，而在低氧或葡萄糖缺乏狀態(tài)下，乙酸鹽可能成為乙酰輔酶A重要來源。乙酸鹽是一種新的、有效的膠質(zhì)瘤治療途徑［13］。已有研究表明，補(bǔ)充乙酸鹽可增強(qiáng)小鼠抵抗應(yīng)激的能力［14］；NaAc通過促進(jìn)p53的升高，可抑制腫瘤細(xì)胞的存活［15］。本文動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaAc可以減小大鼠腦梗死體積；細(xì)胞模型研究顯示，OGD損傷后加入NaAc可減輕神經(jīng)元損傷。因此，NaAc可能是缺血性腦卒中新的潛在治療靶點(diǎn)。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成。每個(gè)亞單位都包含基本的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)異源二聚和DNA結(jié)合［16］。HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性確定了HIF-1α在細(xì)胞功能中具有重要的作用［17］。代謝調(diào)節(jié)是HIF-1α的主要和原始功能。在低氧條件下，HIF-1α可通過調(diào)節(jié)PDK1、LDHA、BNIP3和BNIP3L介導(dǎo)氧化代謝到糖酵解代謝的轉(zhuǎn)變。PDK1編碼丙酮酸脫氫酶（PDH）激酶1，其磷酸化可使PDH失活，從而抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)［18］。本文研究結(jié)果顯示，OGD損傷后神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)增加，NaAc通過抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元存活。因此，在缺血再灌注早期，抑制HIF-1α對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

已有研究結(jié)果顯示，NaAc可自由穿過血-腦脊液屏障和細(xì)胞膜，并且可以增加蛋白的乙酰化［13］。NaAc能通過促進(jìn)p53的表達(dá)，抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而降低HIF-1α的表達(dá)；而增多的HIF-1α可以抑制血管生成，調(diào)節(jié)糖代謝、線粒體功能、細(xì)胞存活等相關(guān)基因的表達(dá)。另有研究表明，HIF-1α升高加重對(duì)缺血性卒中的損傷，抑制HIF-1α表達(dá)可以減輕炎癥反應(yīng)，抑制M1微噬細(xì)胞、iNOS和COX2的促炎活性；此外，HIF-1α還與PKM2相關(guān)基因相互作用，促進(jìn)糖酵解［19］。補(bǔ)充NaAc可能通過促進(jìn)p53的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［20-21］。NaAc還有很多其他作用，如抑制炎癥，促進(jìn)細(xì)胞自主代謝調(diào)節(jié)，從而在細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)發(fā)揮重要保護(hù)作用［22］。本研究通過構(gòu)建大鼠MCAO及原代神經(jīng)元培養(yǎng)OGD模型，探討NaAc對(duì)缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后，大腦內(nèi)神經(jīng)元中HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)，補(bǔ)充NaAc可抑制HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的存活；應(yīng)用HIF-1α激動(dòng)劑和抑制劑研究顯示，NaAc可通過抑制HIF-1α蛋白表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，NaAc可能是通過抑制HIF-1α表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)大腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，NaAc通過抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

［參考文獻(xiàn)］

［1］YUAN M Z， LI F， FANG Q， et al. Research on the cause of death for severe stroke patients［J］." Journal of Clinical Nur-

sing， 2018，27（1-2）：450-460.

［2］RASHID M， ZADEH L R， BARADARAN B， et al. Up-down regulation of HIF-1α in cancer progression［J］." Gene， 2021，798：145796.

［3］LI H S， ZHOU Y N， LI L， et al. HIF-1α protects against oxidative stress by directly targeting mitochondria［J］." Redox Biology， 2019，25：101109.

［4］ZHU T N， ZHAN L X， LIANG D H， et al. Hypoxia-indu-

cible factor 1α mediates neuroprotection of hypoxic postconditioning against global cerebral ischemia［J］." Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 2014，73（10）：975-986.

［5］PANDEY S K， YADAV S， TEMRE M K， et al. Tracking acetate through a journey of living world： evolution as alternative cellular fuel with potential for application in cancer therapeutics［J］." Life Sciences， 2018，215：86-95.

［6］BREWER G J， TORRICELLI J R， EVEGE E K， et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal， a new serum-free medium combination［J］." Journal of Neuroscience Research，1993，35（5）：567-576.

［7］LIU B S， LIAO M X， MIELKE J G， et al. Ischemic insults direct glutamate receptor subunit 2-lacking AMPA receptors to synaptic sites［J］." The Journal of Neuroscience， 2006，26（20）：5309-5319.

［8］XU X Y， CUI Y， LI C Q， et al. SETD3 downregulation me-

diates PTEN upregulation-induced ischemic neuronal death through suppression of actin polymerization and mitochondrial function［J］." Molecular Neurobiology， 2021，58（10）：4906-4920.

［9］CHEN S F， PAN M X， TANG J C， et al. Arginine is neuroprotective through suppressing HIF-1α/LDHA-mediated inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion injury［J］." Molecular Brain， 2020，13（1）：63.

［10］LY J V， ZAVALA J A， DONNAN G A. Neuroprotection and thrombolysis： combination therapy in acute ischaemic stroke［J］." Expert Opinion on Pharmacotherapy， 2006，7（12）：1571-1581.

［11］SONG X Y， SUN X M， OH S F， et al. Microbial bile acid metabolites modulate gut RORγ+ regulatory T cell homeostasis［J］." Nature， 2020，577（7790）：410-415.

［12］MATHEW R， ARUN P， MADHAVARAO C N， et al. Progress toward acetate supplementation therapy for Canavan di-

sease： glyceryl triacetate administration increases acetate， but not N-acetylaspartate， levels in brain［J］." The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics， 2005，315（1）：297-303.

［13］LONG P M， TIGHE S W， DRISCOLL H E， et al. Acetate supplementation as a means of inducing glioblastoma stem-like cell growth arrest［J］." Journal of Cellular Physiology， 2015，230（8）：1929-1943.

［14］HUANG W B， HU W M， CAI L L， et al. Acetate supplementation produces antidepressant-like effect via enhanced histone acetylation［J］." Journal of Affective Disorders， 2021，281：51-60.

［15］PANDEY S K， YADAV S， GOEL Y， et al. Cytotoxic action of acetate on tumor cells of thymic origin： role of MCT-1， pH homeostasis and altered cell survival regulation［J］." Biochimie， 2019，157：1-9.

［16］JIANG B H， RUE E， WANG G L， et al. Dimerization， DNA binding， and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1［J］." The Journal of Biological Chemistry，1996，271（30）：17771-17778.

［17］SEMENZA G L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine［J］." Cell， 2012，148（3）：399-408.

［18］KIM J W， TCHERNYSHYOV I， SEMENZA G L， et al. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase： a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia［J］." Cell Metabolism， 2006，3（3）：177-185.

［19］GRNING N M， RINNERTHALER M， BLUEMLEIN K， et al. Pyruvate kinase triggers a metabolic feedback loop that controls redox metabolism in respiring cells［J］." Cell Metabolism， 2011，14（3）：415-427.

［20］BLAGOSKLONNY M V， AN W G， ROMANOVA L Y， et al. p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription［J］." The Journal of Biological Chemistry，1998，273（20）：11995-11998.

［21］SUZUKI H， TOMIDA A， TSURUO T. Dephosphorylated hypoxia-inducible factor 1alpha as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia［J］." Oncogene， 2001，20（41）：5779-5788.

［22］BOSE S， RAMESH V， LOCASALE J W. Acetate metabolism in physiology， cancer， and beyond［J］." Trends in Cell Biology， 2019，29（9）：695-703.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）