長江典型城區河段在多因素影響下的細菌群落穩定性研究

周鶴林 黎琪 寇德會

摘要：為研究在人類活動和水流運動影響下的長江微生物群落結構穩定性，選取長江廈嘉睦江在重慶城區的河段為研究對象，采用16S rRNA高通量測序QPCR技術進行分析。結果表明：研究河段的細菌總數為5.22×10-1.38×10 copies/mL。長江和嘉陵江細菌群落在門水平上群落組分差異不大，但嘉陵江細菌群落多樣性與豐富度較低。廢水排放與流態變化對水質、細菌群落多樣性指數、細菌總數均沒有顯著影響。但是污水廠排水對細菌群落結構有顯著影響，引起Sporichthyaceae顯著增加和Burkholderiaceae顯著減少。研究河段細菌群落具有豐富的降解外源物質的功能基因，污水廠排水井未導致該類功能基因數量的變化。

關鍵詞：長江；嘉睦江；城市河流；細菌群落；功能基因

中圖分類號：X171 文獻標志碼：A

前言

細菌在水體中降解轉化污染物，改善水體環境，同時水環境變化變化會對菌群的構成和多樣性造成影響。因此細菌群落組成常被用作監測和預測一個水生生態系統健康與否的標準。

長江流域是中國重要的水資源，沿岸污水的排人會引相關水質參數的變化，可能導致菌群的改變。水體自凈作用中的物理凈化、懸浮顆粒的吸附與河流水動力特性有關，因此流態變化可能導致水質和菌群改變。此外，研究發現污水廠排水是河流致病菌的重要來源。對國內外多條河流的致病菌調查顯示，污水廠排水增加了受納水體中多種致病菌的豐度。長江、嘉陵江兩岸人口密集，排污量大，兩江的菌群穩定性關系到該區域的水環境質量。目前對長江微生物群落的研究內容主要針對特定區域微生物群落的構成和分布特征，對于人類活動和水流運動的影響研究較少。

研究于2019年8月下旬在長江和嘉陵江部分河段采樣，基于16S rRNA高通量測序和QPCR技術，分析水體細菌群落特征及其與環境因子的關系，探究水流運動和污水廠排水影響下菌群的變化；借助PICRUSt功能預測分析，研究細菌群落功能基因的構成，為評估長江水生態狀況和合理規劃人類活動提供科學理論依據。

1材料與方法

1.1研究區域樣品采集與水質理化指標測定

2019年8月22日在重慶城區長江與嘉陵江匯合河段至雞冠石污水廠下游共設置11個采樣點，如圖1所示。雞冠石污水廠是重慶市最大、全國第五大污水廠，日處理能力為80萬噸，污水處理量占重慶主城污水處理量的55%。在每個采樣點采集2L表層水體，其中1L用于高通量測序，1L用于水質指標測定。采樣現場記錄水溫和采樣點坐標，同時，使用ST300D型便攜式溶解氧儀檢測溶解氧（DO），PHB-4型便攜式pH計檢測pH。水樣采集后冷藏運回實驗室進一步處理分析。1L水樣經孔徑為0.22 um的無菌微孔濾膜過濾，濾膜在-20℃下冷凍保存。總氮（TN）、總磷（TP）和化學需氧量（COD）按《水和廢水監測分析方法》（第四版）進行檢測。采用tecplot軟件對河段流場數據進行模擬得出各采樣點流速。

1.2樣本DNA提取、PCR擴增及高通量測序

濾膜樣本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用FastDNASPINkitforsoil（MPBiomedicals，USA）試劑盒提取樣本DNA。DNA完整性檢測使用1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA濃度、純度檢測均采用NanoDrop2000（ThermoFisherScientific，USA）.送檢的樣本經檢驗滿足：有明顯條帶，且清晰完整，無降解；OD260/280在1.58-2.08之間。采用細菌通用引物338F-806R對16SrRNA基因的V3-V4區進行PCR擴增。擴增的反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，35個循環；72℃延伸1 min。PCR擴增反應體系為20 uL，其中含：5×FastPFuBuffer4 uL，2.5 mMdNTPs2 uL，正反向引物各0.8 VL（5 uM），FastPFu聚合酶0.4 uL，牛血清蛋白（BSA）0.2 uL，模板DNA10 ng，用雙蒸水補至20 uL。采用上海美吉生物醫藥科技有限公司的MiSeqPE300測序儀（Illuminalne，SanDiego，CA，USA）進行序列測定。原始數據已上傳至美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）序列讀取存檔（sequence read arcruve，SRA），數據所屬登錄號為：PRJNA663032。

1.3測序數據分析

對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，然后在97%相似度下用Usearch（verSlon7.0）進行OTU聚類，并將OTU代表序列比對SILVA數據庫（Release132，http：//www.arb-silva.de）進行物種分類學分析。利用Mothur（Versionl.30.1）計算樣本的a多樣性指數（Shannon、Simpson、ACE、Chaol和Coverage）。采用QUME計算樣本的unweightedUniFrac多樣性矩陣，然后用R語言繪制PCoA圖，ANOSIM分析檢驗組間差異顯著性。為探究細菌群落與環境因子的關系，利用R語言進行冗余分析（RedundancyAnalysis，RDA）。功能預測采用PICRUSt軟件進行分析，將OTU表與KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數據庫進行比對，獲得功能預測信息，具體分析步驟基于在線分析平臺（http：//pioust.github.io/picrust/）。

1.4細菌總數qPCR定量

細菌總數通過qPCR進行計數，總細菌數的DNA片段擴增使用正向引物1369F：5-CGGTGAATACGT-TCYCGG-3，反向引物1492R：5-GGWTACCITGT-TACGACW -3，退火溫度為55℃。qPCR反應采用三個平行樣，每個反應體系為10 uL，包括5uL的2×PremixExTaq，200 nM每種引物，0.1 uL的50 xROX作為參照染料以及1 uL的DNA模板。空白對照包含所有相同的反應試劑，但是用1 uL的無菌水替代DNA模板。制備DNA標準品每次上樣同時做標準曲線（r2>0.99）。記錄標準品擴增效率，每次擴增效率相似，為91%-99%，具體數值取決于實際試驗。

1.5統計分析

利用IBMSPSSStatistics26進行統計分析。Shapiro-Wilk檢驗用于檢驗數據是否符合正態分布。t檢驗用于檢驗符合正態分布的兩組數據的差異顯著性。Mann-WhitneyU檢驗用于檢驗不符合正態分布的兩組數據的差異顯著性。

2結果與分析

2.1水體理化指標分析

各采樣點水質理化參數如表1所示。各水質參數隨采樣點位置不同而有所差異，水溫的變化可能主要來自于采樣時間的不同（采樣時間跨度為早上到下午）。pH較為穩定?？偟獫舛容^高，總磷濃度低。COD的最高值出現在長江和嘉陵江未匯合前，隨著二者的匯合，COD下降了49%，這可能是由于水量的增大稀釋了COD濃度。COD在S5、S7和S8均出現升高，前者可能是由于污水廠的排水，后兩者可能由于河道的突然變窄，而后隨著水流，COD值總體呈下降趨勢。t檢驗結果表明，污水廠上下游的水質參數不存在顯著差異（p>0.05）。一些采樣點（S7、S9）的流速較低（0.2m/s左右），但并未出現有機物和營養鹽的濃度高值。近年來，氮磷，尤其是磷，已成為影響長江水質的主要污染物質。而在研究河段，除了總氮的濃度較高外，其它水質參數均達到Ⅱ類水質標準。

2.2細菌群落多樣性指數分析

11個樣品共得到617 952條高質量序列，每個樣品32 858～74 136條序列。依據97%相似度劃分，共得到1 278條OTUs，每個樣品的OTU數目為644-897。通過評估各樣品的細菌群落多樣性指數（如表2所示），表明嘉陵江（S2）水體中細菌群落多樣性（Shannon指數：3.44）和豐富度（Chaol指數：643.04）都低于長江水體（除S2號點以外的10個樣本點）細菌群落的多樣性（Shannon指數：4.31-4.72）和豐富度（Chaol指數：942.52-1 172.60）。長江水體的細菌群落多樣性（Shannon指數：0.56-5.42）和豐富度（Chaol指數：137-12 601）在較大范圍變動，該河段的細菌群落多樣性和豐富度較為穩定。t檢驗結果顯示，污水廠上下游水體的細菌群落多樣性指數不存在顯著性差異（p>0.05），各流態、流速不同的采樣點細菌群落多樣性指數也不存在顯著性差異（p>0.05）。

2.3細菌群落組成分析

長江水體中優勢細菌門類有：放線菌門（Actinobactena，41.02%-54.15%）、變形菌門（Proteobacteria，22.51%-35.18%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，9.56%-14.60%）和藍細菌門（Cyanobactena，4.70%-13.30%）（如圖2所示）。嘉陵江水體中細菌群落構成與長江水體相似，差異在于放線菌所占比例更高（68.78%）。這些細菌都是河湖等淡水水體中的典型細菌，長江和嘉陵江的細菌群落已被發現主要由這些細菌門類以及厚壁菌門（Firmicutes）構成，但各門類的比例隨采樣時間和位置存在差異。

2.4細菌群落構成相似性分析

利用PCoA分析各樣本的細菌群落構成相似度（如圖3所示）。對雞冠石污水廠排水口上下游樣品進行分組，上游S1、S3、S4為Gl組，下游S5至S11為G2組。PCoA分析表明，G2組樣品（S5-S11）成聚集狀態，說明G2組各樣本的細菌群落構成較為相似，不受流速、流態變化的影響。Gl組S2和S3聚集，而S1與S2、S3較為分散，可能是因為Sl在嘉陵江匯人前，S2、S3在嘉陵江匯入后，嘉陵江的匯人引起了細菌群落結構的變化。通過ANOSIM相似性分析進一步發現，污水廠排水口上下游的細菌群落結構存在顯著差異（p<0.05）。沈杰等也研究發現污水廠上下游的微生物群落構成存在顯著性差異，表明污水廠排水對河流微生物群落有影響。

2.5細菌群落構成與環境園子關系

應用RDA分析細菌群落構成與環境因子的關系（如圖4所示）。結果表明，對研究河段細菌群落影響最大的環境因子是pH，其次是COD，然后是溫度，總磷（TP）對細菌群落的影響最小。pH與COD、溫度呈負相關，COD與溫度呈正相關。放線菌門（Actinobacteria）與水溫、流速和COD呈正相關關系，與TP、DO、pH呈負相關關系。變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）與pH、DO、TP正相關，與COD、流速、水溫負相關。藍細菌門（Cyanobacteria）與COD、pH、DO呈正相關關系，與TP、TN、水溫、流速負相關。河流微生物群落受到氣候、水文、營養物質等眾多環境因子的共同影響。研究沒有水文氣象條件變化，主要分析水質指標對河流微生物群落的影響。

2.6顯著性差異物種分析

對雞冠石污水廠上下游豐度差異顯著的物種進行分析。在科分類水平上，共有2個科的細菌存在顯著豐度差異，主要為孢魚菌科（Sporichthyaceae）和伯克氏菌科（Burkholderiaceae）。相比污水廠上游，Sporichthyaceae在污水廠下游顯著增加，而Burkholderiaceae顯著減少。Sporichthyaceae屬于放線菌，研究發現其通過降解顆粒有機物進行生長，能夠在不利條件下生存，同時對環境的變化有很好的適應能力。Burkholderiaceae屬于變形菌，包括了很多的人類和動物致病菌以及條件致病菌。

2.7功能基因預測分析

利用PICRUSt預測的各樣品KEGG通路包括代謝、遺傳信息處理、細胞過程和環境信息處理等幾個功能組。其中，代謝通路所占比例最高（69.5%71.2%）。代謝通路中外源物質的降解和代謝功能基因與細菌對污染物的降解有關，所有樣品具有的該類別功能基因中基因數最高的包括苯甲酸鹽（Benzoate降解基因、氨基苯甲酸鹽（Aminobenzoate）降解基因、己內酰胺（Caprolactam）降解基因以及氯代烷烴（Chloroalkane）和氯代烯烴（Chloroalkene）降解基因。各樣品相比較，嘉陵江細菌群落（S2）具有的降解和代謝外源物質的功能基因數最多。結果表明，除了阿特拉津（Atrazine）和DDT降解基因外，其它各外源物質降解代謝基因的相對豐度均為嘉陵江細菌群落（S2）最高。污水廠下游除了S7的污染物降解功能基因相對豐度較高外，沒有發現污染物降解基因的明顯富集。有研究發現，有毒化學物質的存在會增加微生物的代謝酶和代謝路徑。但是，污染物降解功能基因豐度和污染物濃度的關系還尚不明確，需要進一步的研究。

3結語

嘉陵江和長江水體均具有豐富的浮游細菌，細菌總數達到5.22×10-1.38×10 copies/mL，細菌群落構成主要包括放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和藍細菌門。嘉陵江菌群豐富度和多樣性低于長江，但放線菌在菌群構成中具有更高的比例。污水廠排水對細菌群落結構造成了顯著影響，引起Sporichthyaceae顯著增加和Burkholderiaceae顯著減少。河流流速、流態變化并未引起水質、菌群多樣性指數、群落結構和細菌總數的顯著變化，表明細菌群落不受水流運動的影響。影響研究河段細菌群落的主要環境因子有pH、COD和水溫。PICRUSt功能預測分析表明，嘉陵江細菌群落具有最多的外源物質降解和代謝功能基因，對于大部分外源物質，其降解和代謝的功能基因的相對豐度也最高。污水廠排水并未導致該類功能基因的富集。